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ilyily
Nuovo Arrivato
12 Messaggi |
 Inserito il - 05 febbraio 2011 : 18:16:18
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ciao a tutti!qualcuno sa fornirmi un protocollo per congelare/scongelare cellule in adesione?dove posso trovarlo?
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Dex
Nuovo Arrivato
Città: Milano
12 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2011 : 15:30:59
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Congelamento: procedi normalmente al passaggio delle cellule fino ad ottenere il pellet. Poi risospendi in 1,5ml di medium di congelamento contenente 10% DMSO, 10-20% FBS e il restante di medium che usi per la coltura. Molti, invece di mettere il 10-20% di FBS ne mettono il 90% (quindi senza medium). Raccogli in una cryovial da 2ml e congeli.
Scongelamento: prendi la cryovial dall'azoto liquido, la immergi per metà in un bagnetto a 37°C e la lasci per circa 2 minuti, finchè la sospensione non è scongelata a meno di una piccola "pallina" di ghiaccio. Raccogli tutto in una provetta, poi procedi centrifugando, risospendendo nel medium e piastrando a piacimento. |
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Erika86
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 10 febbraio 2011 : 13:32:35
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Ciao ilyily,
allora confermo quello che ha detto Dex aggiungendo alcune cose che magari potranno esserti utili.
Io per la crioconservazione risospendo le cellule con medium addittivato con 50% di FCS e 10% di DMSO. Quindi raccogli in cryovial e congeli. Occhio però,perchè il congelamento deve avvenire molto lentamente, quindi è consigliato fare un primo passaggio a -70°C per 12 ore e successivamente mettere le vial in azoto liquido.
Altrimenti le molecole d'acqua presenti romperebbero la membrana delle celluline, causandone la morte.
Al contrario, il processo di scongelamento deve avvenire il più rapidamente possibile, quindi metti in bagno termostatato a 37°C per 1-2 minuti poi ti trasferisci sotto cabina biologica e disinfetti la vial PRIMA DI APRIRLA con alcol. Poi puoi procedere con la tua normale prassi di coltivazione cellulare. Non è necessario effettuare una centrifuga perchè essendo una linea cellulare in adesione il DMSO che rimane disperso nel medium non compromette la loro crescita.
Anche se con un pò di ritardo spero di esserti stata utile!!! |
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