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Fannullone84
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
 Inserito il - 11 febbraio 2011 : 18:12:58
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Il problema è il seguente: se voglio vedere i livelli di espressione di una proteina in seguito ad alcuni condizionamenti, possano essere farmaci o altro... la tecnica più efficace è il Western Blot?
Non sarebbe più "preciso" procedere in altro modo, con un ELISA Sandwich, sui lisati cellulari?
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Piccolastella
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 21:18:03
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| Puoi anche analizzare l'espressione dell'mRNA mediante PCR Real Time, che non è condizionato dal tuo sistema cellulare. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 21:30:38
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I livelli di mRNA non rispecchiano necessariamente i livelli di proteine.
Il Western blot può essere una tecnica sufficientemente precisa in alcuni casi, meno in altri, dipende. Sicuramente in media è più economico di un ELISA. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 21:54:08
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
I livelli di mRNA non rispecchiano necessariamente i livelli di proteine.
Quotando tutto ciò, se ti interessa determinare i livelli di espressione proteica puoi anche performare un'analisi con spettrometria di massa, sebbene di sicuro non sia per niente economica. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 22:49:25
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Citazione:
Quotando tutto ciò, se ti interessa determinare i livelli di espressione proteica puoi anche performare un'analisi con spettrometria di massa, sebbene di sicuro non sia per niente economica.
...ricordando però che in tal caso dovresti servirti di un
approccio MS quantitativo (SILAC, label-free, absolute),
non essendo la spettrometria di massa in grado di predire
- da sola - l'abbondanza relativa di una specie proteica. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 23:00:11
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Citazione:
Quotando tutto ciò, se ti interessa determinare i livelli di espressione proteica puoi anche performare un'analisi con spettrometria di massa, sebbene di sicuro non sia per niente economica.
...ricordando però che in tal caso dovresti servirti di un
approccio MS quantitativo (SILAC, label-free, absolute),
non essendo la spettrometria di massa in grado di predire
- da sola - l'abbondanza relativa di una specie proteica.
O un approccio ICAT o ITRAQ , per le ragioni di cui sopra.
Lo sto studiando proprio adesso  |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 23:28:38
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| Yeap ;) |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 18:31:30
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Un piccolo dubbio: per ICAT normalizzo il numero di cellule dai campioni A e B, le liso, estraggo le proteine, derivatizzo separatamente con label isotopici e dunque mischio i due campioni, digerisco con tripsina (per es.), prefraziono con una cromatografia per affinità con avidina e via di cromatografia multidimensionale e ESI+analizzatore.
Per SILAC posso normalizzare le cellule e fondere i due campioni in un'unica provetta, di modo tale da normalizzare eventuali variazioni casuali nella lisi ed estrazione, magari dovute alla manualità? Questo pensando che le proteine sono già state differenziate durante il periodo di crescita in coltura...
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 20:40:19
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Citazione:
Per SILAC posso normalizzare le cellule e fondere i due campioni in un'unica provetta, di modo tale da normalizzare eventuali variazioni casuali nella lisi ed estrazione, magari dovute alla manualità?
Non è che puoi: devi. E' il maggiore vantaggio della tecnica,
poter fare tutto in un'unica processazione riuscendo comunque
a distinguere il campione d'origine grazie alla marcatura isotopica. |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 21:56:09
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Dalle slide di cui dispongo si evincerebbe che i campioni vadano mischiati solo a partire dalla digestione con tripsina. A me sembrava più vantaggioso condurre un'unica lisi ed estrazione sui due campioni cellulari, di modo da azzerare la variabilità inter-provetta. Forte appunto del fatto che la differenziazione delle colture è realizzata a livello della coltura, prima ancora della lisi ed estrazione dei campioni, come invece avviene per ICAT e iTRAQ.
Perciò la tua risposta ha suffragato la mia idea e te ne ringrazio |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2011 : 00:33:52
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Non ne sono sicuro, ma penso che ci sia chi segue un protocollo simile a quello che proponi tu.
Proverò a chiedere ai proteomici del labbo |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2011 : 00:58:13
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Grazie ancora, attendo buone nuove
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Livelli Espressione proteine - Quali tecniche prediligere?
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