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ele-norabiotec
Nuovo Arrivato

1 Messaggi

Inserito il - 11 febbraio 2011 : 21:57:11

Ciao a tutti!
Sono Eleonora e mi sono appena iscritta a questo forum...
Per la mia tesi di specialistica devo fare una quantificazione proteica tramite Western Blot.
Ho bisogno di porvi una domanda alla quale non trovo risposta negli articoli scientifici.
E' possibile co-incubare la membrana sia con l'anticorpo x il gene housekeeping B-actina sia con quello per la mia proteina target di modo ke nella stessa lane della membrana io ottenga 2 bande confrontabili?
C'è qualcuno che l'ha fatto? Perchè negli articoli dicono ke hanno fatto la normalizzazione ma nn specificano come.
Grazie a chiunque vorrà rispondere.

Dex
Nuovo Arrivato

Città: Milano

12 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2011 : 12:33:12

In genere incubi con l'anticorpo di tuo interesse e sviluppi una lastra. Se il risultato ti soddisfa puoi fare una normalizzazione rispetto a una proteina housekeeping come l'actina, lavando la tua membrana con appositi solventi (si chiamano restoring buffer o stripping buffer) che ti permettono di togliere l'anticorpo legato e di partire da zero con un secondo anticorpo, nel tuo caso l'anti-actina. Se hai caricato in tutti i pozzetti una stessa quantità di proteine, l'actina non dovrebbe variare. Le eventuali piccole variazioni vengono tenute in considerazione quando fai la quantizzazione della proteina di tuo interesse. Per fare questo, si acquisiscono le lastre con uno scanner e si fa un'analisi densitometrica (grandezza e intensità delle bande). Per ogni lane, rapporti i valori densitometrici della tua proteina con quelli dell'actina. Alla fine hai un'analisi quantitativa relativa. Spero di esserti stato utile.

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2011 : 15:02:09

Ci sono svariati modi per farlo:
1) è quello che ha detto Dex
2) se le due proteine (la tua proteina di interesse e la proteina housekeeping) hanno pesi abbastanza diversi, ad es. 50kD e 100kD puoi tagliare la membrana in 2 orizzontalmente ad es. a livello di 70kD e incubi ciascun pezzi con l'anticorpo specifico
3) solo se hai già testato i due anticorpi separatamente e sei sicura che non diano bande aspecifiche nei tuoi campioni puoi incubare prima con un anticorpo e poi con l'altro in modo da avere entrambe le bande sulla stessa membrana.
Le ultime 2 opzioni sono ancora più belle se hai la possibilità di avere un metodo di rivelazione fluorescente perché puoi vedere le bande di colore diverso: