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Alessia
Nuovo Arrivato
Prov.: Roma
Città: Roma
59 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2011 : 18:47:56
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Ciao a tutti ho qualche domanda che non oso fare in lab:
1) il DNA si può vortexare (velocità 3-4?
2) io lo conservo a -20°C quanto è sensibile al congelamento-scongelamento e quanto questo può influire sulla pcr?
3) il DNA ,primers e dNTP quando li scongelo lo posso fare a RT o è meglio in ghiaccio?
4)se ipoteticamente il DNA si è un pò degradato mi consigliate di metterne di più nella reazione o di prendere una polimerasi più sensibile e efficiente?
ho dei problemi con una pcr non mi esce quelle banda! a volte quando osservo il gel mi sembra di immaginarmela!! sto impazzendo.... HELP! 
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Piccolastella
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 20 febbraio 2011 : 20:55:39
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Il DNA (immagino tu intenda genomico) e resistentissimo.
Si può vortexare a bassa velocità. Anzi, si deve, visto che non lo si può mischiare con una pipetta, in quanto si rischia di romperlo se non è estremamente diluito. Ma basa anche agitare un po' con il dito la provetta per mischiarlo.
Va conservato a -20°C e si può scongelare/congelare praticamente all'infinito, dura decenni! Se lo devi utilizzare più volte nel giro di poco tempo, diciamo devi farci 1 PCR al giorno, puoi tenerlo anche in frigo a 4°C senza alcun problema.
(occhio che diversissimo è il discorso se si tratta di DNA virale)
Durante l'esecuzione della PCR, tieni a T ambient primer e dNTP, anche questi si degradano poco. L'unica cosa da tenere in ghiaccio è la Taq polimerasi (ma spesso anche queste hanno attività bloccata a TA), leggi le istruzioni.
Se hai dubbio che il DNA genomico si sia degradato, prima di tutto controllane qualche microL con eletroforesi su gel (agarosio al 1%) e vedi subito se vedi una banda netta o uno smear. Se vedi parzialmente uno smear, la prima cosa da provare è aggiungerne di più nella reazione di PCR (3-4 volte tanto). Se hai a disposizione una Taq più efficiente puoi provare anche con quella, ma prima controlla se il DNA è effettivamente parzialmente degradato.
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 21:06:20
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| il dna genomico nn va vortexato mai. Altrimenti lo frammenti. Basta tiltare un pò la provetta cn il dito x risospenderlo.tenere il genomico a 4 gradi va bene,ma attenta che col tempo puo crescere qlcs nella sol.ne o puoi contaminarla.meglio fare aliquote usa e getta da tenere a meno 20.per dntp e primer,meglio scongelarli on ice.se hai fretta a scongelali a rt.i piu fragili sn i dntp,fai aliquote in piccoli volumi,da cong scong il meno possibile |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 20 febbraio 2011 : 21:08:35
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| un ultima cosa,nn vergognarti di chiedere in lab!è normale avere dubbi! |
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