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 Plasmide non si esprime più...
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domi84
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Smile3D
Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 20:58:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho trasfettato un plasmide che ho usato 1000 volte (e funzionava) e non vedevo nessuna proteina. "ok, sarà successo qualcosa, si sarà degradato", quindo ho ri-preparato una maxiprep da una vecchia preparazione del plasmide, l'ho trasfettata: Tutto ok. si esprime!
Dopo una settimana ri-trasfetto il plasmide: niente! "Ok, sarà il buffer EB che è contaminato con una DNasi (!?)", ripreparo il buffer EB, ripreparo la maxi-prep da una preparazione vecchia (diversa dalla precedente, non si sa mai), la trasfetto, la proteina si esprime! Ok! Dopo una settimana, ri-trasfetto: niente, non si esprime più!!!!
AAAAAAAAAAAAaaaaaaaaaaahhh!!!!
Qualcuno ha un'idea di cosa possa essere successo?

il Plasmide è conservato a -20

P.S. E anche stasera fps online, cioccolata e testate contro il muro...

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 21:25:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma hai provato a correrlo su gel,qnd nn ti funziona piu?

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 21:41:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Strano, non è mica così facile degradare un plasmide.
Piuttosto usi sempre lo stesso reagente di transfezione?

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:10:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
in effetti un problema cn la trasfezione o cn i reagenti che usi sembra piu probabile.usi mai 1 cntrollo di trasfezione?che so, gfp...

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:20:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sempre lo stesso reagente (lipofectamina), ho un controllo di trasfezione perchè trasfetto anche altri plasmidi contemporaneamente e quelle si esprimono (anche con una buona espressione), domani provo a correre un po' di plasmide.
Vi faccio sapere...

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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:28:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Tra la prima e la seconda transfezione sicuro che non c'è nessuna differenza? A livello di reagenti, di protocollo..qualsiasi cosa.
Le cellule sono sempre le stesse?
In che modo vedi se la proteina si espressa o no?
Il controllo di transfezione in ogni caso mi sembra indispensabile perchè ti permette di capire se si tratta di un problema di transfezione o di plasmido.
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Flap
Utente Junior



172 Messaggi

Inserito il - 22 febbraio 2011 : 22:36:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Flap Invia a Flap un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Abbiamo pubblicato contemporaneamente..se il controllo ci sta è un problema di plasmido, magari della funzione della proteina che stai transfettando. Che strano..se fossero batteri ti direi che a me è successo qualcosa di simile e alla fine ho scoperto che c'èra una variabilitá tra le colonie che analizzavo, cioè che in alcune si esprimeva e in altre no...e per questo mi sembrava che a volte si esprimeva e altre no, ma in questo caso mi sa che non ha molto senso.
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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2011 : 21:42:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho corso il plasmide digerito con un Enzima di restrizione (per vedere la forma linea) e l'altezza di corsa è quella giusta, non ci sono degradazioni. Ho fatto uno spettro da 240 a 300 nm del plasmide e mi appare un picco di assorbanza a 258, non sono presenti altri picchi.

Altre idee?

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2011 : 21:52:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
avrei detto reagenti o cellule,ma se i controlli di trasfezione ti vengono... Come determini se la proteina è espressa?

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 01 marzo 2011 : 22:48:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Western Blot

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


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Inserito il - 02 marzo 2011 : 01:51:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Potrebbe benissimo essere la variabilità biologica dell'esperimento.

Potresti non essere sempre nelle migliori condizioni
di efficienza di gene transfer perchè la tua proteina
venga espressa in maniera detectabile.

Otherwise: variabilità tecnica nel tuo western, ovvero
non diamo per scontato che la proteina possa esserci
ma che magari - a volte- il western non ti venga.

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


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Inserito il - 02 marzo 2011 : 01:54:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In pratica i tuoi controlli positivi di transfezione
potrebbero essere "troppo positivi"

E' una signorina difficile, questa proteina?

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


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Inserito il - 02 marzo 2011 : 10:13:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
lol, una signorina difficile
Sono d'accordo con Dionysos sul fatto che l'esito wb nn deve essere dato per scontato. PARALLELAMENTE al wb, potresti guardare se il gene in questione è espresso a partire dal suo mRNA. La cosa pero' si complicherebbe se il gene fosse espresso anche a livello endogeno: nel caso il tuo costrutto fosse taggato potresti fare una RT-PCR (reverse transcriptase) e disegnare un primer nel tag e uno nella sequenza codificante di detto gene.
Domanduccia: hai parlato di maxi prep...Il tuo sistema è endotoxin free?(anche se mi aspetterei una citotossicità generale sulle tue cellule piu' che un blocco trascrizione/traduzione)

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


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Inserito il - 02 marzo 2011 : 11:21:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io e la signorina ci conosciamo da anni, e si esprime abbastanza bene! Nell'esposizione da 5 minuti si vede proprio bene (una bella bandazza). Mi pare strano passare da 100 a 0...in 1 settimana! Le altre proteine non sapevo come si esprimessero, quindi la mia mi serviva anche come controllo. Ed è successo esattamente l'opposto!

Provo a scongelare altre cellule...non si sa mai. Il gene è taggato, quindi posso provare a fare la RT.
Per i WB ora me li ri-guardo e vedo se noto qualcosa di curioso...Grazie per i consigli!

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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 02 marzo 2011 : 11:34:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, lo sai che in western dire "5 minuti" è come non dire niente : il tempo che ci mette a saltar
fuori dipende da quanto carichi, , da quanto è fresca la diluizione del tuo anticorpo, da quanto è
fresco il lisato, dal tipo di reazione che usi, da quanto è recente la reazione (se è ECL), e da un
sacco di altre cose con in ultima istanza l'abbondanza assoluta della proteina.

Il western - purtroppo - ti dà un'idea quantitativa solo quando
paragoni una banda ad un'altra nello stesso gel rispetto ad un
normalizzatore interno. Se hai fatto così allora sì, puoi dire
"si esprime bene/si esprime dimmerd/ecc..

Puoi comunque uscirne: se hai dei controlli positivi appropriati
interni al western (ovvero: la stessa proteina, magari endogena, in
altri campioni) allora puoi escludere il problema tecnico del WB e
iniziare a pensare che sia una magagna di tipo biologico.


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