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antoniojr86
Nuovo Arrivato
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24 Messaggi |
 Inserito il - 26 febbraio 2011 : 13:04:10
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Salve a tutti, sono alle prese con un sistema citato nell'articolo che ho allegato nella discussione. In pratica si parla della via Wnt e del sistema TOPFLASH/FOPFLASH con il quale si va a capire l'importanza della via che coinvolge la beta-catenina e il coattivatore della trascrizione Tcf1 tramite un sistema di inserimento di un plasmide. Voi ne sapete di più su questa tecnica? Io non riesco proprio a raccapezzarmi! Grazie!
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SpemannOrganizer
Utente
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955 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 15:13:14
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Ciao, nn credo che tu possa allegare pdf, quindi non stupirti se i mod te lo tolgono.
In realtà il sistema è abbastanza semplice, si tratta anzitutto di un reporter. Cioè un costrutto che ti rivela se e quanto un particolare gene è trascritto. Nella fattispecie, il topflash contiene diversi elementi di legame per il fattore trascrizionale Tcf, vale a dire sequenze di DNA che Tcf riconosce e lega. Di per se Tcf è un repressore trascrizionale, generalmente, e si attiva solo in seguito al legame con la beta catenina, quando quest'ultima trasoca nel nucleo. E, se conosci la via Wnt, saprai benissimo che la beta-cat si accumula nel nucleo solo quando la via Wnt è attiva.
Ora, nel sistema topflash accanto al promotore chimerico (Tcf-binding elements) trovi anche il gene per la lucifierasi. Quindi, se attivi la via Wnt in cellule (per esempio aggiungendo Wnt) trasfettate preventivamente con un plasmide Topflash, avrai un aumento della trascrizione della luciferasi, e questo aumento di attività lo puoi misurare con un saggio luminometrico.
Il fopflash non è un altro che un controllo negativo, in quanto i siti di legame per Tcf hanno mutazioni, quindi la trascrizione della luciferasi non avviene nemmeno in presenza di wnt attiva. Questo ti dimostra che l'attivazione della luciferasi è specifica e avviene solo in presenza di wnt e dei normali siti di legame. In genere, si fa anche un controllo negativo con il topflash senza aggiungere wnt, e dei controlli di normalizzazione interna per normalizzare parametri come efficienza di trasfezione ecc (generalmente si usa la renilla, un'altra luciferasi che usa diversi substrati ed è sotto il controllo di un promotore costitutivo come CMV, SV40 o TK).
Spero di essere stato chiaro
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Patrizio
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Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 15:39:20
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| non essendo free, ho dovuto rimuovere l'articolo |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Patrizio
Moderatore
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antoniojr86
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 26 febbraio 2011 : 16:50:08
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| dimenticavo una cosa... esistono sistemi TOP in cui la luciferasi è sostituita con una GFP o altra fluorescent protein. Vengono chiamati TOP-GFP mi pare, e sono usati spesso in modelli animali per avere un reporter della via Wnt in vivo (noi ne abbiamo uno in Xenopus laevis). |
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antoniojr86
Nuovo Arrivato
Prov.: Firenze
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Inserito il - 26 febbraio 2011 : 16:54:34
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Tra l'altro, ora, vedevo che viene inserito, anche un altro plasmide, dove c'è un gene di resistenza per la doxorubicina e una per il dnTCF (determinant negative). Questo comporterebbe la trascrizione del gene della resistenza all'aggiunta della Doxorubicina, e la trascrizione del gene vicino TCF, che può competere con il vero TCF nel legame con la beta-catenina... Naturalmente, l'aggiunta di doxorubucina non porta segnale luminoso... Può essere che io abbia ben capito?  |
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antoniojr86
Nuovo Arrivato
Prov.: Firenze
Città: Firenze (ma di TA)
24 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2011 : 16:57:20
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| Ah, e oltre alla minor luminescenza, si dovrebbe avere anche una diminuzione di cellule in fase S, questo perchè i geni per la proliferazione non sono trascritti. |
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SpemannOrganizer
Utente
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Inserito il - 26 febbraio 2011 : 17:46:03
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non conosco questo sistema, ma se mi mandi un link gli do un'occhiata
dn-Tcf sta per dominant negative, non determinant negative. E' una versione di Tcf che manca del dominio di legame con la beta-cat, quindi si comporta da repressore trascrizionale sia con Wnt attiva che non (cioè diventa un repressore costitutivo). |
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antoniojr86
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SpemannOrganizer
Utente
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955 Messaggi |
Inserito il - 27 febbraio 2011 : 11:43:54
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allora ho dato un'occhiata guardando solo il costrutto che usano. Questo è un costrutto inducibile dalla doxyciclina, che è un analogo della tetraciclina ed è usata in sistemi tipo Tet-on o Tet-off per attivare (o reprimere) la trascrizione. Il sistema da loro usato è basato sul T-Rex della invitrogen, di cui nn conosco molto ma dando una rapida occhiata al sito invitrogen vedo che contiene un promotore CMV/TetO (Tet Operator, che conferisce inducibilità in risposta a tetraciclina o derivati come doxyciclina). Quindi è simile al TetON.
Cio' vuol dire che inducendo dnTCF dopo aggiunta di doxyciclina, inibisci la via Wnt (ti ricordo che dn-Tcf è un dominante negativo). Questo risulta in un arresto del ciclo cell poichè la trascrizione di Myc (gene che regola il ciclo cell) è sotto il controllo (positivo) di Tcf/beta-cat. dn-Tcf quindi inibisce la trascrizione di Myc. D'altra parte p21, un inibitore del ciclo cellulare, è sotto il controllo opposto, cioè i suoi livelli aumentano quando la via è inattivata, provocando quindi l'arresto della proliferazione delle cellule quando dn-Tcf è attivato.
Chiaro? |
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Discussione |
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Sistema TOPFLASH/FOPFLASH e via Wnt
Didattica
