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Matteo87
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 Inserito il - 01 marzo 2011 : 12:22:03
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Buongiorno, volevo farvi questa domanda perchè è un esempio di un tema d'esame di biotecnologia....ho provato a rispondere però non ho la conferma che la mia risposta sia giusta:
Domanda
Allora io ho una certa sequenza (che non sto ascrivere perchè non dovrebbe essere necessaria), questa sequenza appartiene a un gene che codifica per un recettore del ferro. La proteina è considerata di interesse biotecnologico. Descrivere la tecnica di clonaggio per l'espressione del gene in E.Coli usando il plasmide pUC19.
I miei siti di restrizione dono HIND3 PSTL BAMHI EcoRI
Mia Risposta
1)Dato che all'inizio ho solo quella seq, eseguo la PCR denaturando e raffreddando più volte per amplificare il numero di sequenze in dotazione e i primer.
2)Una volta che ricavo molte sequenze e molti primer, creo sei siti di restrizione sui primer attraverso l'endonucleasi BAMHI.
Uso dei promotori inducibili e processivi come PT7 o PBad, perciò introduco nel plasmide anche il gene per RNA POL di T7 o di PBad.
Uso sempre BAMHI per tagliare il plasmide di pUC19 successivamente il pezzo di DNA viene introdotto nel plasmide pUC19 attraverso la ligasi.
Trasformo il plasmide ricombinnante in E.Coli e in esso si duplica.
3)Ora potrebbe anche succedere che il plasmide si richiude su se stesso senza acquistare il DNA da clonare, quindi la cellula acquista il plasmide ma non il DNA che cerco.
Per assicurarsi che il clonaggio abbia luogo provo a fornire XGAL a E.Coli. Dato che ho introdotto il gene in LacZ(per beta - galattosidasi), se il gene è entrato LacZ non produce beta - galattosidasi e si osserva perch la cellula si colora di bianco.
4)Eseguo il piastramento per recuperare le cellule bianche che includono il plasmide con il pezzo di DNA acquistato.
5)E.Coli sintetizza le sue proteine inclusa quella di interesse, però non funziona tutto perfettamente perchè il folder di tali proteine può anche essere errato, dato che E.Coli ha uno spazio interno riducente.Per assicurarmi di non avere modifiche post-traduzionali introduco le foldasi(e qua vi chiedo:si però come le introduco le foldasi??????).
volevo chiedere:
Come faccio a introdurre le foldasi?
é giusto parlare di spazio interno riducente?
le foldasi che cosa vanno a sistemare precisamente della mia prot?
Come separo le proteine di interesse da quelle che produce in più E.Coli, con una cromatografia?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 00:18:30
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Premesso che non ho avuto modo e soprattutto tempo di leggere tutto il post ma l'ho letto solo qui e là, mi sono venute due considerazioni in mente, una stupida e l'altra più pertinente:
a) quella stupida perché è una sottigliezza, oltre a Xgal dovrai somministrare alla cellula anche IPTG, induttore.
b) le foldasi credo si riferiscano a chaperonine che io ho sempre sentito nominare come PDI (protein disulfide isomerase), le quali sono implicate nella formazione dei ponti disolfuro nel Reticolo Endoplasmatico. Esse si rivelano particolarmente importanti negli Eucarioti specialmente per le proteine che possono formare più potenti disolfuro (es. l'emoagglutinina dell'Influenzavirus conta ben 6 cistine), in quanto per tali polipetidi è alto il rischio che i legami disolfuro siano aspecifici altrimenti.
Per farti un'idea di come superare questo problema dovresti cercare qualche informazione sull'insulina ricombinante, mi sembri un ragazzo volenteroso e dunque non dubito che lo farai ben volentieri. Agli esordi, infatti, la sua sintesi si rivelò infruttuosa, proprio a causa dell'incapacità di E. coli di formare legami S-S.
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So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Matteo87
Nuovo Arrivato
53 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 18:49:08
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Ok grazie intanto, il fatto è che nn trovo nessuna informazione su come si faccia a introdurre queste foldasi in E.Coli per evitare modifiche post traduzionali....me lo sapresti dire?e poi volevo sapere se il motivo per cui si formano legami disolfuro errati dipenda dal fatto che ha uno spazio interno riducente.
Grazie
ciao |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 20:06:01
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| Se lo spazio è riducente, e lo è, non si formano proprio i ponti disolfuro. |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 21:39:32
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| pensavo,ma nn è che ste foldasi vengono aggiunte in vitro anzichè in E. coli?ipotizzo semplicemente, visto che non ne ho mai sentito parlare |
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Matteo87
Nuovo Arrivato
53 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 21:43:43
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| E ma se le aggiungo in vitro che faccio poi?cioè dovrebbero essere in E.Coli per evitare modifiche post traduzionali.....perchè almeno sarei sicuro che le mie prot siano funzionali |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 02 marzo 2011 : 22:48:13
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L'ambiente interno è riducente a causa dell'alto rapporto NADPH/NADP+, anche se tu formassi i legami disolfuro nella cellula molto probabilmente essi andranno ridotti. Tant'è vero che nella cellula eucariota essi vengono formati soltanto nel Reticolo endoplasmatico, dove questo rapporto scende da 500:1 a 5:1 e le proteine che subiscono tale modifica vengono quindi esocitate oppure, se di membrana, mantenute con i ponti S-S in ambiente extracellulare.
Tuttavia ricorda che le proteine si folderanno naturalmente in ambiente riducente, perché i ponti disolfuro stabilizzano il folding, ma non lo guidano. Perciò dovresti avere la tua proteina in forma foldata, ma in un conformazione poco stabile.
Perciò credo che innanzitutto dovresti recuperare la tua proteina dal batterio, indurre perciò E. coli a trasferire all'esterno la proteina. Magari dotarndola di una sequenza di trasferimento all'ambiente extracellulare (FtsY-Ffh pathway mi pare). La sequenza segnale richiesta è uno stretch di residui idrofobici all'N-terminale, preceduti di solito in posizione 2 o poco più all'interno da uno o due residui carichi.
Una volta liberata all'esterno, la proteina si troverà in un ambiente ossidante, le tue proteine tenderanno a formare ponti disolfuro CASUALMENTE. Potrebbero per esempio formarsi ponti inter-catena. Per ciò ti serve un enzima che ne guidi la formazione.
Comunque il mio consiglio migliore è:
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1
Per farti un'idea di come superare questo problema dovresti cercare qualche informazione sull'insulina ricombinante, mi sembri un ragazzo volenteroso e dunque non dubito che lo farai ben volentieri. Agli esordi, infatti, la sua sintesi si rivelò infruttuosa, proprio a causa dell'incapacità di E. coli di formare legami S-S.
Non posso aiutarti oltre, anche perché dopodomani sono sotto esame |
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Matteo87
Nuovo Arrivato
53 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2011 : 12:49:53
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Ok trovato, le foldasi si clonano in E.Coli, cmq sull'insulina ricombinante in internet è meglio non cercare, io ho trovato solo un gran casino, però alla fine da altre fonti ho scoperto che queste foldasi vanno clonate.
Per l'induttore invece che cè da fornire insieme a XGAL in Coli si può dare anche l'allolattosio perchè IPTG è una sostanza artificiale correlata all'allolattosio.
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 05 marzo 2011 : 13:39:14
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| D'accord, giusto ieri sera mi chiedevo come procedeva la tua ricerca |
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naima
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 16 marzo 2011 : 16:14:25
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Ciao a tutti!! ho un questito per voi. Devo ligare due frammenti di DNA eluiti da gel che hanno un'estremità coesiva Bamh1, che poi una volta ligati dovranno essere inserire in un plasmide per il clonaggio. Purtroppo è un bel pò che ci sto provando ma non riesco a farli ligare. Leggendo qua e là mi sono resa conto che è un problema molto frequente, quindi ho cercato di risolverlo facendo correre il DNA in gel Low melting, anzichè agarosio, che dovrebbe interferire meno con la reazione di ligasi. Il risultato è stato anche questa volta negativo..Avreste qualche consiglio??
Grazie a tutti e buon lavoro!!! |
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