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biologomolecolare84
Nuovo Arrivato
Prov.: Rm
Città: Roma
69 Messaggi |
 Inserito il - 04 marzo 2011 : 09:25:33
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Ciao a tutti...Volevo chiedere un parere a chi sicuramente ha più esperienza di me nelle trasformazioni batteriche.
Ho effettuato la trasformazione di cellule DH5alpha con 3 diversi prodotti di ligazione e ho fatto anche i rispettivi controlli in cui ho aggiunto soltanto il vettore tagliato con due enzimi di restrizione diversi (teoricamente non dovrebbe richiudersi).
Il risultato ottenuto è che, nella coppia ligazione1-CNTRL1 non vedo colonie nelle due piastre; nella coppia ligazione2-CNTRL2 vedo le colonie solo nel CNTRL, mentre nella coppia ligazione3-CNTRL2 vedo sostanzialmente lo stesso numero di colonie in entrambe le piastre.
Tempo fa ho trasformato solo i vettori in queste cellule e la trasformazione è venuta molto bene al primo tentativo.
Questo mi fa ipotizzare che le DH5alpha sono ok e che il problema sia nella ligazione.
Ho messo a ligare 40 ng di vettore con gli inserti in rapporto 1:3 molare (come da protocollo della ligasi usb) e, l'unica cosa che non ho la possibilità di controllare è l'efficienza di restrizione dei prodotti di pcr purificati. Un esperto mi ha detto che in presenza di clumps GCGC (il mio prodotto di PCR sarà = GCGC-RS1-sequenza-RS2-GCGC)gli enzimi dovrebbero digerire molto bene, mentre io sapevo che non è così, e che bisogna prima clonare in un vettore con le T protruding (tipo T-Vector) che permetta il clonaggio dei prodotti di pcr, e poi tagliare con gli enzimi desiderati (solo così si è sicuri della specifica restrizione).
Qualcuno può confermare o smentire questa informazione?
Grazie a tutti per gli eventuali suggerimenti.
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Analisi Trasformazione Batterica
Didattica
