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MikAnd83
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 11 marzo 2011 : 16:37:02
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Ciao a tutti,umili omaggi da neoiscritto!
Mi serve aiuto per una restrizione sequenziale di un vettore con enzimi AGE I e EcoRV. Controllando sul sito NEB mi viene consigliata una digestione doppia:
Digest in NEBuffer 1 + BSA at 37°C.
At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. Attivita' di EcoRV 50% con BSA e 100% per AGE I
Se volessi farla sequenziale??Inattivo il primo enzima a 65 C e poi devo cmq purificare con Kit Qiagen prima di fare la seconda digestione?Consigli un qunantita' di enzima da usare per vettore e inserto?
Grazie in anticipo!
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 11 marzo 2011 : 17:34:59
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| Non c'è bisogno di inattivare se purifichi con il kit spin columns. Quindi fai prima una digestione, purifichi e riparti con la seconda. La quantità di enzima da usare dipende dalla quantità di DNA che digerisci. |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2011 : 14:19:18
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Se usi enzimi della stessa ditta non è necessaria nessuna purificazione in between...
fai la prima inattivi a 65 aggiungi il secondo enzima e via in incubazione per la seconda digestione....
questo se il buffer comune va bene...
se non andasse bene fai la prima digestione con il buffer con la concentrazione minore di sali poi inattivi aggiungi quel poco di sali che devi e aggiungi il secondo enzima...
la seconda è la migliore soluzione...sempre funzionato nel caso di buffer incompatibili o rischio di star effect...
ma non purificare un bel nulla tra le due restrizioni...perdi solo materiale e basta... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2011 : 16:30:53
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se puoi utilizzare un buffer comune non vedo alcuna ragione di splittare la reazione in due, puoi direttamente aggiungere entrambi gli enzimi no? 
Se come in questo caso non puoi utilizzare un buffer comune, in my opinion la purificazione rimane la strada piu' veloce e migliore: via i sali e via l'enzima. Purtroppo va via pure un po' di DNA, ma per esperienza posso dirti che nn ne perdi cosi' tanto e quello che ti ritrovi è sufficiente per il clonaggio (immagino che tu stia andando a fare un clonaggio, o sbaglio?). |
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gilthanas
Nuovo Arrivato
100 Messaggi |
Inserito il - 12 marzo 2011 : 21:14:33
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confermo che se l'uso del buffer comune è possibile non c'è bisogno di farla sequenziale...
Se non ti fidi a farla doppia contemporaneamente, visto che il double digest ti dice che uno dei 2 non funziona benissimo, puoi farla sequenziale usando i buffer come suggerito precedentemente.
Ti mettevo solamente in guardia che se la fai sequenziale non è necessario purificare i mezzo alle 2 digestioni, visto che perdi solo materiale e alla fine della seconda digestione devi comunque purificare nuovamente. Quindi per la 2 digestione basta aggiustare solamente la concetrazione dei sali e poi alla fine purificare con colonnine.
Credo di essere stato più chiaro |
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MikAnd83
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 14 marzo 2011 : 14:01:17
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Grazie per l'aiuto,oggi provo la digestione contemporanea in buffer 1, se non ho risultati provo con una sequenziale con purifica tra i due step.In caso vi chiedero' ancora aiuto |
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MikAnd83
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 17 marzo 2011 : 21:05:13
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Ho effettuato la restrizione doppia con le condizioni consigliate da il sito NEB. Digest in NEBuffer 1 + BSA at 37°C.
At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary. Attivita' di EcoRV 50% con BSA e 100% per AGE I.
La digestione e' riuscita, ho controllato il digerito su gel,confrontandolo con il non digerito.
Prima di effettuare la CIP del vettore ho purificato (con fenolo-cloroformio  ..non avevo kit di purificazione a disposizione).Tutto bene per ora...
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Restrizione sequenziale
Didattica
