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Pearly
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Inserito il - 19 marzo 2011 : 18:38:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pearly Invia a Pearly un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
ho un dubbio: è necessario fosforilare l'inserto dopo aver fatto il fill-in con la Klenow? Se si che protocollo mi consigliereste?
Inoltre dopo aver bluntato devo purificare su gel o basta inattivare l'enzima con il calore?

Un'altra domanda su Klenow:
navigando su internet ho scoperto che l'attività esonucleasica 5'-3' del frammento di Klenow non è efficiente e che in caso di estremità 3'protruding è meglio utilizzare la T4 DNA polimerasi. E' un'informazione attendibile?

Grazie

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 19 marzo 2011 : 23:49:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non c'è bisogno di fosforilare perchè i 5' del tuo inserto sono già fosforilati (a meno che non sia un prodotto di pcr con primer nn fosforilati e nn digerito... ma nn credo visto che si tratta di fill in).
Per quanto riguarda la seconda domanda, forse ti riferisci alla attività esonucleasica 3'->5'. In tal caso la risposta è si', è meglio usare la T4
Fammi sapere se hai ancora dei dubbi

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Pearly
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2011 : 13:54:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pearly Invia a Pearly un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si esatto..intendevo l'attività esonucleasica 3'-->5'! GRAZIE!

Però il dubbio sulla fosforilazione rimane. Se è necessario defosforilare plasmide in cui devo clonare l'inserto dopo la digestione enzimatica, vuol dire che l'enzima di restrizione può lasciare il gruppo fosfato sul 3', quindi il corrispondente 5' del frammento exciso non sarà fosforilato. Giusto?
Perciò anche se faccio il bluntaggio non è certo che le estremità 5' dell'inserto siano fosforilate (nel caso in cui l'enzima crei estremità 5' overhang)
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2011 : 22:45:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao pearly. Credo che tu abbia un po' di confusione. Il vettore in genere viene defosforilato, come dici tu (per prevenirne la ricircolarizzazione). I gruppi fosfato sono sempre sul 5' mai sul 3'(-OH).Quindi se defosforili togli i fosfati dal 5' del vettore.
Andiamo all'inserto: prendiamo il semplicissimo caso che tu amplifichi per pcr con dei primer che contengono dei siti di restrizione (poco importa, ai fini di questa spiegazione, che siano blunt o 5' o 3' overhang). Dopo aver amplificato, digerisci con i tuoi enzimi che tagliano tra un nucleotide e l'altro lasciando libera un estremità 3' OH e una 5'-P (fosfato).
Es: EcoRI 5'GAATTC 3' --> 5' G-OH 3' 5'P-AATTC 3'
In poche parole la digestione stessa ti "scopre" il fosfato 5' che poi viene sfruttato nella reazione di ligazione.
Spero di esser stato chiaro.

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Pearly
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 20 marzo 2011 : 22:54:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Pearly Invia a Pearly un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille!!!! Chiarissimo!
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