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 autofluorescenza su sezioni di cervello
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Heather
Nuovo Arrivato

Prov.: Teramo
Città: Montorio al Vomano


12 Messaggi

Inserito il - 30 marzo 2011 : 23:41:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Heather Invia a Heather un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Lavoro con sezioni di cervello di topo su cui effettuo tantissime immunofluorescenze, ma sfortunatamente ci siamo accorti che, oltre alla ben nota lipofuscina, c'è qualcos'altro che dà una specie di autofluorescenza di fondo...qualcuno ha avuto problemi simili?da cosa potrebbe dipendere? io so che la paraformaldeide, con cui viene perfuso il topo, non dà autofluorescenza! spero ci sia una soluzione!!! grazie

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2011 : 08:55:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
A volte redisui di emoglobina danno quel problema. Io perfondo con qualche ml di PBS prima di passare alla PFA e generalmente aiuta.
I fissativi, in quanto aldeidi, danno background fluorescence. La PFA generalmente non dà grossi problemi. Se mai fissassi con glutaraldeide, invece, preparati ad una fluorescenza di fondo piuttosto evidente. In quel caso puoi trattare le fettine con sodioboroidruro (NaBH4). Ovviamente un'opzione è quella di ridurre la concentrazione di fissativo ad es. PFA 2%, anche se io non ho mai avuto troppi problemi a 4%.

Poi ovviamente dipende dagli anticorpi e dalla regione del cervello che stai guardando: alcune zone sono molto "appiccicose".
In quel caso puoi aumentare la concentrazione di BSA durante l'immuno (1-4% dovrebbe essere OK).

Un'altra cosa che puoi usare se la fluorescenza di fondo è davvero resistente è quella di trattare le fettine chimicamente dopo l'immuno.

Questo PDF dà molti dettagli e referenze interessanti.

In sostanza:

Per la lipofuscina puoi usare il Sudan Black 0.3% (w/v) in etanolo 70% (vedi ad es: Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections., questo è il trattamento che ho sempre visto usare).

Un'alternativa a quanto pare è quella di fissare con 0.2% acido picrico e PFA 2% in PBS invece che solo PFA.

Anche l'elastina ed il collagene possono dare autofluorescenza. In quel caso puoi trattare con 0.5% pontamine sky blue o 0.1% toluidine blue per 1-5 minuti.

A quanto pare è possibile fare un trattamento di pre-bleach esponendo le fettine a 4 diverse lunghezze d'onda diverse per 12-48 ore prima di mettere i fluorofori. Non ho mai fatto una cosa del genere e sinceramente a meno che tu non sia in una situazione disperata eviterei un trattamento che mi raddoppia la lunghezza dell'esperimento...

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Heather
Nuovo Arrivato

Prov.: Teramo
Città: Montorio al Vomano


12 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2011 : 12:38:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Heather Invia a Heather un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
@chick80
grazie! ho trovato molto interessante i tuoi link...cmq anche noi in genere perfondiamo prima con PBS e poi con PFA 4% e per l'immuno usiamo BSA 4%. In parte credo dipenda anche dallo spessore della sezione (14 micron al criostato)...ora stiamo studiando la regione dei ventricoli laterali e alcune cellule ependimali sembrano autofluorescenti...mah! è da indagare! cmq grazie ancora
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