estrazione DNA plasmidico

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Autore

Discussione

jovy
Nuovo Arrivato

102 Messaggi

Inserito il - 07 aprile 2011 : 21:29:16

Salve a tutti...
Ho fatto una estrazione di un plasmide da cellule di E.coli...
E' lungo circa 4,7Kb...Purtroppo su gel (agarosio 1%) migra sopra l'ultima banda del marker...(che è di 10kb!). Ho le due classiche bande...quindi la prima è questa di circa 10Kb e la seconda è ancora più pesante!
Qualcuno può suggerirmi qualcosa...
Grazie

SpemannOrganizer
Utente

Città: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 07 aprile 2011 : 21:36:22

cosa del tutto normale. Le forme che vedi sono superavvolto, nick relaxed etc... per vederne la corretta migrazione (cioè il corretto molecular weight) lo devi linearizzare

Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma

83 Messaggi

Inserito il - 09 aprile 2011 : 22:20:39

Non ho capito bene il tuo problema,

gilthanas
Nuovo Arrivato

100 Messaggi

Inserito il - 09 aprile 2011 : 23:42:04

E' chiaro il tuo problema...è una cosa normale anche se normalmente un pò improbabile...

per una "gran sfiga" hai beccato una colonia che probabilmente aveva incorporato sì il tuo DNA plasmidico, ma ha prodotto un CONCATENAMERO o MULTIMERO...
ossia una DNA circolare a doppio filamento ma che contiene più di una copia del tuo plasmide in questione...2 o più concatenate insieme...quindi molto più pesanti dell'atteso se corso su gel d'agarosio...

in questo caso la linearizzazione (cosa utilissima per conoscere l'esatte dimesioni di un plasmide) non servirebbe a nulla....spezzerebbe queste concatenazioni riportando il tuo plasmide alle dimensioni attese...ma non ti farebbe rendere conto delle dimensioni totali del plasmide...

...se vuoi puoi provare a ricaricare il tuo plasmide insieme ad uno di dimensioni note che hai in lab di cui sei sicuro delle dimensioni per escludere che il tuo problema sia stato di corsa...perchè ogni tanto i superavvolti possono fare certi scherzi per esempio se il buffer di corsa è un pò vecchio o non preparato correttamente...

l'unico consiglio che mi sento di darti è solamente ripartire dalla piastra della trasformazione e riprendere un paio di altre colonie, espanderle e fare altre 2 mini-preps...tutto qui...
ma hai avuto proprio sfiga...però capita....