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Limpet
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Inserito il - 13 aprile 2011 : 20:21:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti di nuovo, ormai siete il mio riperimento fisso e mi fa piacere avere con chi discutere, cosa che in lab mi manca molto.
Ho una sequenza, ottenuta non per clonaggio, ma diretta che volevo mettere in banca dati. E' una cds, la citocromo ossidasi, e da ignorante, ho fatto una submission in Genbank per avere la referenza per un articolo, dopo avere avuto conferma da blast che fosse la specie che immaginavo fosse. In genbank mi hanno detto essere piena di codoni di stop, che non può avvenire in una coding!! Era una sequenza pulita, non ci ho lavorato molto.Così oggi l'ho tradotta con bioedit e mi mette in alcuni punti fra gli aa degli asterischi: TAHAFVMIFFLECQF*SEDLEIDLFPYI*GLQIWPSLD.
Andata in blast con la sequenza tradotta, me la riconosce come citocromo ossidasi.
Le mie domande sono: cosa sono gli asterischi? e come vedo dove sono i codoni di stop? e quindi, come non ripetere lo stesso errore...?

grazie

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2011 : 20:52:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma è piena di codoni di stop in tutti i frame di lettura?

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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


83 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2011 : 21:46:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Questa è una cosa che ho già sentito..., cioè?
quando vado in bioedit, seleziono la sequenza e faccio: translate in selected frame, e traduce!
invece?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2011 : 22:53:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
dico che se la fai tradurre nel frame nn corretto, è chiaro che ti da un sacco di codoni di stop! dovresti tradurla nel frame corretto. Mi sorgeva questo dubbio perchè hai detto che con il blast ti ha dato il risultato che ti aspettavi, ossia la citocromo ossidasi. Ma il blast sulla sequenza nucleotidica ti allinea la sequenza senza tradurla (a meno che nn faccia il blast tn, se non erro, che però credo ti traduca in tutti e 6 i possibili frame - 3 senso e 3 "antisenso").
Io ho conoscenze molto limitate di bioinformatica, quindi ti suggerisco di chiedere a qualcuno piu' esperto. A mio avviso però il tuo è solo un problema di individuare il frame corretto. Al tuo posto, procederei così: traduco la sequenza in tutti i possibili frame (su ExPASy trovi ottimi tool come questo http://expasy.org/tools/dna.html) poi tra tutti i possibili 6 frame guardi quello che ti da la sequenza amminoacidica aspettata, a rigor di logica con un solo codone di stop (se la sequenza è la sola ORF senza ulteriori UTRs). Per essere sicuro puoi comparare la sequenza aa ricavata con quella già depositata della citocromo ossidasi (sempre che sia stata depositata e che si tratti della stessa).

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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


83 Messaggi

Inserito il - 13 aprile 2011 : 23:10:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...medito sulle tue parole....e ti faccio sapere,
grazie
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2011 : 07:23:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
puoi anche fare un BLAST sulla sequenza proteica ed in effetti quella sequenza dà come risultato la citocromo ossidasi.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins

Cosa c'è nella sequenza nucleotidica dove hai gli asterischi?

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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
Città: Roma


83 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2011 : 10:54:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Ho fatto già sia blast-p che blast-n. In pratica io utilizzo la sequenza della citocromo ossidasi come barcoding per identificare una specie, un idrozoo, in particolare, e, sia a blast-p che blast-n mi danno come risultato citocromo ossidasi e la specie che mi aspettavo.

nella sequenza con gli asterischi, e ne ho tanti, ho:
FLIIFDNNF*IKLKGRGNLDRDNVA*SLAI*LMDSMNG*TNIPLS*RESKKIEIVVKMLFKIVRRKDPIELHYTLFITNETYFLN*GVW*FSWGDYFLNLTKASNVNDKFTV*LNFLTVINIGHNDPLCFQN*TQRSIDKSYLRDNRIILF*SSYRK*SLSPLC*I

sono andata su Expasy, come consigliava Spemann, e in tutti i frame mi da codoni di stop. Ma la cosa forte e che mi la da anche per la sequenza che in genbank mi da come massima identità (98%), ed è sempre una cds!
Non so più dove mi incarto! Ma poi, non capisco una cosa: perchè ho 6 frame di lettura per una sequenza?
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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
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Inserito il - 14 aprile 2011 : 11:33:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok, ho capito perchè ho 6 frame di lettura, sorry per l'ignoranza. Sono algi inizi e il mio utilizzo di questa materia è limitato...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2011 : 19:14:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No, no, io chiedevo, nel DNA che cosa c'è quando nella proteina c'è un asterisco?

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2011 : 19:55:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh, generalmente asterisco=codone di stop

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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
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83 Messaggi

Inserito il - 14 aprile 2011 : 20:05:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

come lo vedo in modo rapido? o conto sequenza e triplette manuale..?
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ipa
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 14 aprile 2011 : 20:17:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ipa Invia a ipa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dunque mi sembra assodato che se contiene codoni di stop non è un cds...Il fatto che tu trovi un'identità del 98% mi fa pensare (e lo puoi verificare tu dall'allineamento della sequenza su blast-n ) che ci siano in alcuni punti della tua sequenza dei "gap" rispetto al gene di riferimento (ovvero delle differenze nucleotidiche) corrispondenti molto probabilmente ai tuoi stop quando la traduci in proteina. Quindi blast ti dice che la tua sequenza corrisponde ad una citocromo ossidasi (98% di identità!) ma la sequenza non è tutta giusta!Comunque se ci scrivi la sequenza nucleotidica ci risulterà più semplice risponderti.
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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
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Inserito il - 24 aprile 2011 : 12:03:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vi allego il file....?ma posso allegare qui?
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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
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Inserito il - 24 aprile 2011 : 16:51:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
fatto!
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Limpet
Nuovo Arrivato

Prov.: Roma
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Inserito il - 28 aprile 2011 : 23:21:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Limpet Invia a Limpet un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ti ho inviato il file in forma privata, ti è arrivato?
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