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Maypa84
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7 Messaggi |
 Inserito il - 16 aprile 2011 : 11:00:57
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Ciao tutti!!
Allora vi illustro il mio problema...sono solita fare WB su estratti proteici di mioblasti e non ho mai avuto problemi nell'utilizzo della beta-TUB come loading control. Infatti nonostante caricassi veramente pochi microgr di proteine (al max 8 dato che dalle mie piastrine si tira fuori poco o nulla) non ho mai avuto problemi a trovarmi un buon segnale dopo 10sec di esposizione della lastra dopo ECL. E fin qua tutto bene...
...finchè non abbiamo deciso di voler valutare l'espressione di una proteina su estratti proteici di SEZIONI DI MUSCOLO SCHELETRICO UMANO.
Dopo varie prove osservo che per avere un segnale della mia proteina decente non posso caricare meno di 20 microgr per campione (quindi piu del doppio rispetto a quanto carico per gli estratti da cellule)..
La proteina mi viene BENISSIMO...ma in compenso la tubulina mi viene superflebilissimerrima!! Talmente flebile che mi è impossibile normalizzare!!
Partendo dal presupposto che:
1. E' IMPOSSIBILE che ci sia meno tubulina rispetto ad un atrogene qualsiasi in un muscolo sano.
2.L'anticorpo è nuovo, quindi non ci sono problemi di primario.
3. Sempre il primario è quello che uso anche su cellule e li funziona da dio
4.L'ho gia concentrato di piu rispetto a quanto lo uso su cellule.
5.L'ultima incubazione l'ho fatta 18h ON a 4°
....
NON SO PU CHE FARE!!!
Premettendo che non sono una biochimica mi appello a voi per qualche consiglio...
La prima idea che mi è venuta è cambiare Loading control...però anche qua è problematico!!:
1.ACTINA: Impossibile, su muscolo scheletrico in vivo ce nè troppa...ho gia provato tempo fa a fare la miosina su 20microgrammi superdiluita e mi si brucia la lastra perchè è veramente troppa.
2.GAPDH: Un ricercatore mi ha detto di starci attenta su muscolo perchè è modulata troppo, quindi preferirei non usarla!
3.ALFA TUBULINA: Potrei provare con l'alfa sperando di nn avere problemi??
Scusate se sono prolissa, ma vorrei veramente risolvere sto problema!!
Ultima info, le mie biopsie da cui taglio NON sono fissate ma sono congelate cosi come ci arrivano!!
GRAZIE!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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Maypa84
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 16 aprile 2011 : 11:33:11
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| no...estraggo in SB- e poi centrifugo come con le cellule... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 11:54:18
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| domanda: per il musclo scheletrico usi lo stesso metodo di estrazione delle proteine che usi con i mioblasti? Se sì, forse non è adatto per quel tessuto e devi utilizzarne un altro... |
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Maypa84
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 12:43:37
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
domanda: per il musclo scheletrico usi lo stesso metodo di estrazione delle proteine che usi con i mioblasti? Se sì, forse non è adatto per quel tessuto e devi utilizzarne un altro...
ma MI da problemi solo la tubulina!! tutti gli altri blot che ho provato mi vengono....peccato che non mi venga il piu importante!!! ='((
estraggo in SB- poi...non aggiungo niente di piu e niente di meno!! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 14:39:52
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| ok, allora ti chiedo: è possibile che il livello di beta-tubulina nel muscolo scheletrico differenziato (quindi non mioblasti) sia ridotto rispetto ad altri tipi cellulari (o rispetto agli stessi mioblasti)? Non mi intendo di differenziamento muscolare, però il citoscheletro di queste cellule è molto organizzato, specializzato, e pensavo che magari la tubulina facesse posto a quegli altri elementi (miosina, actina etc) che permettono la contrazione delle fibre muscolari... |
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Maypa84
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 18:56:13
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ottima domanda, è la stessa che mi sono posta anchio.
E' vero che il citoscheletro delle fibre muscolari è ben strutturato ed organizzato e di certo la tubulina non è la proteina principale costituente. Ma ho chiesto ad un ricercatore della mia università che si occupa di citoscheletro e mi ha detto che comunque è presente e sicuramente detectabile (in teoria).
Ma anch'io, presa da questo dubbio, mi sono detta: CAMBIAMO LOADING CONTROL!!
Ma se non posso fare la tubulina (a questo punto ne la alfa ne la beta), non posso fare l'actina, non posso fare la GAPDH....cosa posso fare? sto impazzendo ='(
Tieni in considerazione che sulla mia membrana ho tutte le proteine fra i 37 e i 200 KDa....
grazie
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 19:25:19
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beh io un tentativo per l'actina lo farei lo stesso, magari diluendo tantissimo l'ab. E farei un tentativo pure per l'alfa tubulin, non sia mai che l'anticorpo per l'alfa sia piu' sensibile di quello per la beta...
Altri loading control? uhmmmm stavo pensando a qualche proteina ribosomiale, ma non so se possa fare al caso tuo... |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 19:27:26
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| o qualche elongation factor come eIF etc... |
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Maypa84
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 16 aprile 2011 : 19:36:51
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
beh io un tentativo per l'actina lo farei lo stesso, magari diluendo tantissimo l'ab. E farei un tentativo pure per l'alfa tubulin, non sia mai che l'anticorpo per l'alfa sia piu' sensibile di quello per la beta...
Altri loading control? uhmmmm stavo pensando a qualche proteina ribosomiale, ma non so se possa fare al caso tuo...
lunedi provo con l'alfa tub...per ultima provo l'actina anche perchè se, come penso, anche diluendola tantissimo mi brucerà la lastra, quella membrana la posso buttare [quando ho fatto la prova con la miosina dopo anche strippando la membrana il primario mi era comunque rimasto tanto legato da darmi un segnale assurdo]...
sto wend ho lasciato a saturare l'ECL in modo tale da vedere il massimo che posso ottenere con la bTUB e vedere se posso normalizzare per farmi almeno un'idea.. |
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Maypa84
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 18 aprile 2011 : 14:04:53
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| AGGIORNAMENTO....l'over weekend è anbdato una ***** [scusate la volgarità]...peggio della mezz'ora...non so a che santo votarmi al momento ='( |
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jeje
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52 Messaggi |
Inserito il - 03 ottobre 2011 : 13:42:35
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ciao anche io lavoro sul muscolo scheletrico e ho lo stesso problema con la tubulina...a volte mi viene perfetta a volte è troppo poca...tu hai risoplto il problema?
grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
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Maypa84
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2011 : 11:34:26
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Citazione:
Messaggio inserito da jeje
ciao anche io lavoro sul muscolo scheletrico e ho lo stesso problema con la tubulina...a volte mi viene perfetta a volte è troppo poca...tu hai risoplto il problema?
grazie
ciao...purtroppo problema non risolto...ho provato con 5 anticorpi diversi e stesso risultato...a volte viene e a volte no, rendendo irriproducibile qualsiasi tipo di esperimento! tu hai provato qualche altro controllo? |
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Western Blot, PANICO TUBULINA
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