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angy7
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 04 maggio 2011 : 16:17:23
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ciao a tutti è da diversi mesi che ho problemi con il western blot; il problema principale è che non riesco ad ottenere bande dell'actina uguali, cioè alcune sono più intense altre molto meno.
Le diluzioni degli anticorpi 1° e 2° sono 1:5000 (anti-mouse)
uso gel precasted.
Descrivo brevemente la procedura che utilizzO:
preparo i ul di campione da caricare nel gel con simple buffer
gli dò una breve centrifugata (pochi secondi) o sarebbe meglio usare il vortex per rendere omogenea la soluzione?
faccio correre nel gel prima a 200V poi dopo 20 min a 140V: durata 50 min.
Poi trasferimento per 30 min a 100V. riutilizzo il buffer di trasferimento 2 o 3 volte e lo conservo ogni volta nella stessa camera che uso per il trasferimento coprendola solamente con parafilm.
potrebbe essere che il metanolo evapori e non funzioni bene?
poi agito la membrana in 10 ml di latte al 5% (in tbs/tween)
e diluisco gli anticorpi 1° e 2° sempre in latte al 5% (1:5000)
Il 1° lo lascio o/n a 4C° e il 2° per un'ora a Tambiente. poi lavaggi con tbs/tween e infine TBS
poi lascio la membrana 1 min in ECL
espongo per 3 min o meno, dipende dal segnale..
quale potrebbe essere il problema?
aiutatemi perchè non so come uscirne....... grazie di cuore a tutti
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 16:49:37
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non ottieni bande paragonabili di actina non per un problema di procedura del western, ma, molto banalmente, perchè carichi quantità diverse, in termini di microgrammi di proteine. il valore che devi considerare quando carichi il gel non è tanto il volume in microlitri, ma la quantità di proteine in microgrammi. questo significa che prima di aggiungere il sAmple buffer (non simple) devi fare un dosaggio allo spettrofotometro e poi normalizzare le quantità. la procedura in questo caso è irrilevante.  |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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angy7
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 16:58:14
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grazie della risposta. comunque io carico 100 ug di proteine o 30 ug di proteine dipende...
ti spiego come faccio:
dosaggio allo spettrofotometro
ottengo la concentrazione delle proteine totali di ogni campione in ug/ml
se ne voglio caricare 100ug (perchè ho visto in passato che ho un buon segnale) mi ricavo da una semplice proporzione i ul di campione da caricare per avere la stessa quantità di proteine (100 ug o 30ug)
spero di essere stata chiara.. ti torna ora? tu dicevi questo?
o tu fai diversamente?
grazie
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 17:41:39
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| se carichi la stessa quantità di proteine nonb capisco perchè il normalizzatore non venga costante, a meno che tu non faccia dei trattamenti che ne riducono le quantità. prova a cambiare e vedi se i segnali di gapdh o tubulina sono uguali |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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angy7
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 17:48:52
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tu dici di cambiare la proteina housekeeping? in realtà poche volte le bande di actina sono venute uguali ma è stato un evento raro..
quindi se poche volte sono venute uguali, ci sarà qualche errore nella procedura? i quesiti che ponevo o altro?
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 04 maggio 2011 : 17:56:42
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| se le proteini caricate sono uguali in quantità tra i campioni allora anche l'housekkepinge sarà costante. è proprio il principio del normalizzatore. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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sabina
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 05 agosto 2011 : 23:39:23
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Salve a tutti è da poco che faccio western blot e non riesco ad avere bande dell'actina uguali, carico 20ug di proteine, potrebbe essere che le concentrazioni delle mie proteine non siano accurate? o abbia fatto qualche errore nella quantificazione? Ho usato metodo Bradford...
Ciao |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 14:29:29
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come era solito dire il mio tutor tedesco where is your primary data? posta le letture ottenute dallo spettrofotometro e i conti .
PS niente vacanze? |
Facebook |
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sabina
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 16:32:05
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eehhh no niente vacanze, qui in America non conoscono Agosto. 
Le mie concentrazioni :
mg/ml mg/ml 20ug Tme 20ug Tme
A2 5,6408 2,3033 3,55 18,95 8,68 13,82
B5 4,7512 1,8459 4,21 18,29 10,83 11,67
B6 6,8172 3,1312 2,93 19,57 6,39 4,86
B6 6,6725 3,0671 3,00 19,50 6,52 4,73
Sono campioni di piastrine umane faccio estrazione con doppio detergente TX100 TX114, devo determinare la proteina Gsaplpha
Grazie
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 06 agosto 2011 : 19:44:59
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scusa ma non ci capisco niente prova a formattare il testo utilizzando i tag [ code ] [/ code ] o allegando un documento word
es
mg/mL | mg/mL
a2| |
b2| |
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Facebook |
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sabina
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 07 agosto 2011 : 02:06:40
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Tx10 mg/ml Tx114 mg/ml 20ug Tme 20ug Tme
A2| 5,6408| 2,3033 | 3,55| 18,95| 8,68 | 13,82
B5| 4,7512| 1,8459 | 4,21| 18,29| 10,83 | 11,67
B6| 6,8172| 3,1312 | 2,93| 19,57| 6,39 | 4,86
B6| 6,6725| 3,0671 | 3,00| 19,50| 6,52 | 4,73
Scusa....spero di essere stata più chiara.....
Grazie
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western blot [housekeeper]
Didattica e Relazioni
