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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm
Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 17 maggio 2011 : 17:03:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao, ho alcune slide criptiche di Citogenetica molecolare che mi stanno dando qualche grattacapo.
L'argomento è la Fluorescent in Situ Hybridization.
Veniamo al dunque:
le poche diapositive mi danno questi semplici imput, citando:

"Metafase in DAPI
Cromosomi
1 Denaturati
2 Colorati con DAPI
3 SOnde puntiformi fluorescenti
Merge Segnali
Sovrapposizione dell'immagine della sonda sull'immagine del DAPI"

Da quel che posso logicamente ricostruire significa che i cromosomi bloccati in metafase vengono prima denaturati, quindi colorati col DAPI e poi si aggiungono le sonde fluorescenti. Quindi al microscopio a fluorescenza si osservano i cromosomi colorati con DAPI, che dovrebbe dare un colore blu/ciano, e in contemporanea si può determinare in che punto le sonde hanno ibridato, sempre che l'abbiano fatto.

Se quanto dedotto è esatto, avrei questi due ulteriori dubbi:
- la colorazione DAPI equivale a fare un bandeggio Q? Immagino di si.
- il DAPI si usa appunto per questo? Per avere un bandeggio caratteristico il quale possa permettere di riconoscere i cromosomi e dunque poter definire su quale cromosoma si ibridizza la sonda?
- colorazione con DAPI e ibridazione con sonde sono sequenziali o richiedono lavaggi intermedi? Cioè le sonde vengono aggiunte ai cromosomi, questi legano ancora DAPI? Oppure viene prima eliminato e perciò la sovrapposizione va effettuata tra un'immagine in tempo reale (attinente alla colorazione con sonda) ed un'immagina acquisita in memoria del bandeggio Q?
- ma il DAPI non dovrebbe andare a intercalarsi in double strand DNA?
- la denaturazione come avviene?

Grazie per l'attenzione

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 19 maggio 2011 : 21:13:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Uppo perché il nugolo di post che si aggiungono di continuo in questa sezione è, raffronatato ad altre, veramente d'ostacolo alla visibilità di questa interessantissima discussione

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2011 : 19:39:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa la fretta nella risposta, ma devo scappare (qua suona l'allarme!)
In breve:
- prima si fanno ibridare le sode e poi si mette il DAPI
vedi ad es. questo protocollo: http://labs.mmg.pitt.edu/gjoerup/FISH%20protocol%20Vysis.doc

il vetrino si guarda al microscopio a fluorescenza prima con un filtro e si fa una foto, poi con un altro filtro e si fa la seconda foto, poi si sovrappongono le foto!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2011 : 21:14:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille, elaboro un po' ed eventualmente posto i miei dubbi.

PS: allarme? Red Alert?

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2011 : 23:03:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
É che in Università la sera inseriscono l'allarme e suona la sirena per avvisare di uscire, sai non volevo rimanere chiusa in lab tutto il weekend. Stavo cercando un protocollo della FISH da postare e ho dovuto fare di fretta.

Comunque cerco di essere più precisa e rispondere alla tue domande.
Citazione:
- la colorazione DAPI equivale a fare un bandeggio Q? Immagino di si.
- il DAPI si usa appunto per questo? Per avere un bandeggio caratteristico il quale possa permettere di riconoscere i cromosomi e dunque poter definire su quale cromosoma si ibridizza la sonda?


Citazione:
- colorazione con DAPI e ibridazione con sonde sono sequenziali o richiedono lavaggi intermedi? Cioè le sonde vengono aggiunte ai cromosomi, questi legano ancora DAPI? Oppure viene prima eliminato e perciò la sovrapposizione va effettuata tra un'immagine in tempo reale (attinente alla colorazione con sonda) ed un'immagina acquisita in memoria del bandeggio Q?

Sì sono sequenziali, ma come ti dicevo prima si fanno ibridare le sonde poi si effettuano dei lavaggi e infine si mette il DAPI.
Quando vai a vedere i vetrini al microscopio devi utilizzare dei filtri diversi per vedere la fluorescenza del DAPI e delle sonde, quindi fai due foto nello stesso campo del vetrino, cambiando solo il filtro senza spostare il vetrino e poi le sovrapponi.

Citazione:
- la denaturazione come avviene?



In genere con formammide e aumentando la temperatura

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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 21 maggio 2011 : 00:11:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie ancora, GFPina, chiara ed esauriente come al solito.
Buon week end fuori dal lab


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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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