Plasmide lineare dopo miniprep????

Forum

Registrati Discussioni Recenti Preferiti Utenti Cerca Regolamento RSS Statistiche

Utilità

I libri
consigliati:

Il patrimonio mondiale dell'Unesco. I santuari della natura
Marco Cattaneo, Jasmina Trifoni

I mille volti della scienza. Cultura scientifica e umanistica nella società
Antonio Fernandez Ranada

La matematizzazione della biologia. Storia e problematiche attuali
Autori Vari

Altri Libri

Nome Utente:	Password:
Riconoscimi automaticamente

Tutti i Forum

Laboratorio

Biologia Molecolare

Plasmide lineare dopo miniprep????

Nuova Discussione

Nuovo Sondaggio

Rispondi

Aggiungi ai Preferiti

Cerca nelle discussioni

Risorse di Biologia Molecolare:

Didattica

Blog Inside the Cell

Protocolli

Siti di Biologia Molecolare e Tecniche

Quiz

Ultime notizie

Aggiungi i tag

Quanto è utile/interessante questa discussione:

Autore

Discussione

roberta.s
Utente Junior

Città: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 20:53:28

Ciao a tutti, ecco il mio problema:
ho clonato un frammento in pGEM-T easy vector, ne ho verificato il corretto inserimento tramite colony pcr e digestione enzimatica, oltre ad aver sequenziato il frammento stesso all'interno del vettore. Fin qui tutto ok.
Mi sono pero' accorta che, digerendo il mio plasmide con un enzima che dovrebbe darmi una sola banda (di circa 4000 bp, più una piccola banda non visibile di 16 bp), ne ottengo invece 2, una di circa 3000 e un'altra di circa 1000 bp, esattamente come se il plasmide fosse lineare. Mi chiedo se sia realisticamente possibile che il plasmide sia lineare... Apprezzerei tantissimo se qualcuno con esperienza in clonaggio mi desse un parere, sto impazzendo perchè devo procedere con un subclonaggio...
Grazie!

SpemannOrganizer
Utente

Città: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 21:10:30

non è lineare. e' molto piu' realistico pensare che il tuo enzima taglia in due o piu' punti, tanto piu' che mi dici che normalmente darebbe una banda di 4000 bp piu' una di 16...

thejoint84
Nuovo Arrivato

46 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 21:34:43

star activity.... daccordo con Spemann....

http://cornermolecularbiology.blogspot.com/

GFPina
Moderatore

Città: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 23:23:40

Concordo con i commenti precedenti, comunque potresti seminare su gel anche il plasmide non digerito! Vedrai che non sarà lineare!

jovy
Nuovo Arrivato

102 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2011 : 12:21:53

è normale che dopo taglio con enzimaq di restrizione tu debba ottenere il plasmide linearizzato...
La cosa che mi viene da pensare è che magari proprio nell'inserto che hai clonato ci sia una sequenza di riconoscimento per l'enzima di restrizione che hai usato...e così hai ottenuto due bande...che infatti sommate danno la grandezza che ti aspettavi...

roberta.s
Utente Junior

Città: Parigi

564 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2011 : 14:57:27

grazie a tutti, ho trovato la soluzione: semplicemente l'inserto è legato a pGEM-T con orientamento opposto a quello che avevo previsto con una simulazione, per cui il pattern di restrizione andava aggiornato secondo la reale mappa del plasmide finale!
Grazie