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 Plasmide lineare dopo miniprep????
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roberta.s
Utente Junior

yeast
Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 20:53:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, ecco il mio problema:
ho clonato un frammento in pGEM-T easy vector, ne ho verificato il corretto inserimento tramite colony pcr e digestione enzimatica, oltre ad aver sequenziato il frammento stesso all'interno del vettore. Fin qui tutto ok.
Mi sono pero' accorta che, digerendo il mio plasmide con un enzima che dovrebbe darmi una sola banda (di circa 4000 bp, più una piccola banda non visibile di 16 bp), ne ottengo invece 2, una di circa 3000 e un'altra di circa 1000 bp, esattamente come se il plasmide fosse lineare. Mi chiedo se sia realisticamente possibile che il plasmide sia lineare... Apprezzerei tantissimo se qualcuno con esperienza in clonaggio mi desse un parere, sto impazzendo perchè devo procedere con un subclonaggio...
Grazie!

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 21:10:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
non è lineare. e' molto piu' realistico pensare che il tuo enzima taglia in due o piu' punti, tanto piu' che mi dici che normalmente darebbe una banda di 4000 bp piu' una di 16...

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thejoint84
Nuovo Arrivato



46 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 21:34:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
star activity.... daccordo con Spemann....

http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2011 : 23:23:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo con i commenti precedenti, comunque potresti seminare su gel anche il plasmide non digerito! Vedrai che non sarà lineare!
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jovy
Nuovo Arrivato



102 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2011 : 12:21:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di jovy Invia a jovy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
è normale che dopo taglio con enzimaq di restrizione tu debba ottenere il plasmide linearizzato...
La cosa che mi viene da pensare è che magari proprio nell'inserto che hai clonato ci sia una sequenza di riconoscimento per l'enzima di restrizione che hai usato...e così hai ottenuto due bande...che infatti sommate danno la grandezza che ti aspettavi...

gi
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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2011 : 14:57:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie a tutti, ho trovato la soluzione: semplicemente l'inserto è legato a pGEM-T con orientamento opposto a quello che avevo previsto con una simulazione, per cui il pattern di restrizione andava aggiornato secondo la reale mappa del plasmide finale!
Grazie
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