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 clonaggio-metodo della inserzione inattivante
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fantastik84
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Inserito il - 07 giugno 2011 : 18:55:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fantastik84 Invia a fantastik84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!!devo sostenere l'esame di microbiologia, corso di scienze agrarie, ma ho alcuni dubbi.
Per quanto concerne il clonaggio dei plasmidi abbiamo visto 3 metodi:
1) metodo della inserzione inattivante: non l'ho capito.
2) trattamento con fosfatasi del plamsmide
3) metodo del clonaggio direzionale utilizzando due enzimi di restrizione.

Non ho capito molto bene il primo metodo, quello della inserzione inattivante.

Tra gli appunti ho scritto tutto ciò ma non ho capito granchè:
Questo metodo(1 metodo) si può applicare quando il plasmide porta due o più resistenze agli antibiotici cioè presenta due o più markers(esempio resistenza all’ampicillina e alla tetraciclina, come il pBR384) e all’interno presenta un sito di restrizione(esempio Ecori).
Entrambi i plasmidi(sia quelli che hanno preso l’inserto sia quelli che non lo hanno preso), vengono trasferiti in Escherichia Coli. Qui vengono isolati e fatti crescere su un substrato contenente Ampicillina. Si usa Ampicillina per vedere quale dei due sia effettivamente quello con l’inserto.

avremo che:
- Escherichia coli che ha il primo plasmide
- Escherichia Coli che ha il secondo plasmide
- Escherichia Coli che non ha proprio niente, nessun plasmide caricato

1) Il primo passaggio è quello di selezionare Escherichia Coli che ha ricevuto questi 2 plasmidi. Per questo motivo si utilizza l’antibiotico, perché Escherichia Coli è sensibile sia all’Ampicillina che alla Tetraciclina. Il fatto che lo si fa crescere in presenza di Ampicillina significa che queste colonie contengono uno dei due plasmidi. Perché?
perchè il gene dell’Ampicillina non è stato interessato dal taglio. Sia nel primo plasmide(quello che si è ricircolarizzato), sia nel secondo plasmide l’Ampicillina è rimasta intatta, quello che è stato tagliato è la Tetraciclina. Quindi facendo crescere Escherichia Coli in presenza di ampicillina crescono sia le cellule che hanno ricevuto il plasmide uno, sia quelle che hanno ricevuto il plasmide due.
Significa che queste cellule hanno ricevuto un solo plasmide, perché crescono in presenza di Ampicillina.

2) Il passaggio successivo è quello di riconoscere quelle cellule, se hanno caricato il plasmide 1(quello che non ha caricato niente) o il plasmide 2 (quello che ha caricato l’inserto cioè il nostro dal DNA). Anche qui ci aiutiamo con gli antibiotici.
Le stesse colonie sono usate per allestire dei masters. Si fa lo stesso master(stesse colonie) che contengono lo stesso tipo di plasmide.

Per selezionare e verificare le colonie che hanno ricevuto l’inserto, si allestiscono dei masters, si vede quelle che sono resistenti all’ampicillina, avendo il nostro inserto il gene resistente a questo antibiotico. [I master servono a isolare delle colonie, a identificarli].
1a colonia: substrato contenente Tetraciclina: le colonie con tetraciclina possono crescere(zio ugo ama zia pia, messaggio completo);
2a colonia: substrato contenente Ampicillina: muoiono alcune colonie con ampicillina perché magari non hanno ricevuto l’inserto(ZIO UGO AMA ZIA P-messaggio interrotto); Resistono e crescono ovviamente le colonie che hanno ricevuto bene l’inserto, che ha il gene di resistenza all’ampicillina.

La maggior parte delle volte si clona a livello di un solo sito di restrizione, ad esempio Ecori(molto usato). Non sempre i siti di restrizione classici come Ecori, BamHI, Cla I, possono essere usati per il dna estraneo(nostro gene) che vogliamo inserire in un organismo.


C'è qualcuno che me lo spigherebbe meglio per farmelo capire, magari pure in poche righe.
#8195;

fantastik84
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Inserito il - 09 giugno 2011 : 13:35:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fantastik84 Invia a fantastik84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nessuno sa aiutarmi???
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thejoint84
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46 Messaggi

Inserito il - 09 giugno 2011 : 16:26:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Secondo me ci sono un sacco di passaggi inutili..... se quello che vuoi é un E.coli con un plasmide che esprime il tuo gene X devi fare questo:

1.prendi un plasmide e ci inserisci il tuo gene
2.trasformi E.coli con il tuo plasmide
3.selizioni per la resistenza sul plasmide
4.con la mini prep ti estrai il dna plasmidico
5.tagli il plasmide, corri su gel di agarosio e se hai fatto tutto bene hai una banda piú pesante di quella che avresti se tagliassi il plasmide nativo (senza il tuo gene)

Forse inserzione inattivante é riferito al fatto che il sito di restrizione che usi(nel plasmide) é all´interno di una resistenza ad antibiotici. E´ se ci metti un gene la resistena si perde, e di conseguenza se ci trasformi un batterio e lo testi per quella resistenza il batterio schioppa..... ma non lo devi fare.... é come dire se ti butti dal decimo piano di un palazzo muori....é cosí e basta...
Spero di esserti stato d´aiuto, se ho capito male la domanda, cerca di essere poco poco piú chiaro ;-)

http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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fantastik84
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Inserito il - 09 giugno 2011 : 21:43:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fantastik84 Invia a fantastik84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao..ti ringrazio innanzitutto della risposta!
Allora veniamo al problema. Quello che ho scritto sono gli appunti del professore riguardo al cosiddetto metodo della inserzione inattivante, di cui non ho capito un bel niente. In pratica questi metodi servono per evitare che quando carichiamo l'inserto sul plasmide, il plasmdide si richiuda su se stesso senza caricare il nostro inserto.
Pertanto riguardo al clonaggio dei plasmidi si è detto che quando si effettua il clonaggio ci sono 2 possibilità:
- il plasmide non ingloba il dna
- il plasmide ingloba il nostro inserto
Nella maggior parte dei casi il plasmide si ricircolarizza su se stesso e non ingloba niente. Per evitare ciò ed arrivare al nostro scopo, cioè far inglobare l’inserto al plasmide, si usano alcuni metodi:
1) metodo della inserzione inattivante: il metodo che ho scritto prima ma non ho capito granchè
2) metodo del clonaggio direzionale
3) metodo della moltiplicazione del plasmide trattandolo con fosfatasi
Questi ultimi due metodi li ho capiti e in pratica consistono:

clonaggio direzionale: Molti plasmidi usati come vettori portano uno o più siti di restrizione. Vengono utilizzati due enzimi di restrizione per far si che il plasmide non si chiudi su se stesso senza caricare l’inserto. Le due zone di taglio non essendo compatibili, non manifestano la tendenza a richiudersi.
Per esempio il plasmide pBR322 contiene due siti, Cla I e Sma: In questo caso si fanno due tagli successivi, una volta con Cla e una volta con Sma. Succede che il plasmide si linearizza e rimane con un Cla da una parte e uno Sma da una parte, e non si può richiudere su se stesso perché non ha le basi omologhe.
Se il plasmide si vuole richiudere deve inglobare il nostro pezzo, avendo anche lui le basi omologhe. In questo caso poiché le 2 estremità del pBR322 non sono coesive poiché tagliate con enzimi diversi, il plasmide non può circolarizzarsi da solo senza caricare l’inserto, che in questo caso forma un ponte.
Il plasmide quindi per chiudersi deve inglobare l’intero dna, che invece ha le basi omologhe.
Normalmente si clona utilizzando un singolo sito di restrizione, ad esempio l’Ecori, che è un sito molto ricorrente e diffuso, in più l’enzima è a buon mercato.

moltiplicazione del plasmide trattandolo con fosfatasi: l'uso dell'enzima fosfatasi che evita che il plasmide si richiuda su sè stesso senza caricare il nostro inserto.
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


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Inserito il - 09 giugno 2011 : 22:22:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Inattivazione inserzionale: il tuo DNA di interesse è clonato all'interno di un altro gene, in passato si prediligeva uno codificante per un fattore di resistenza ad antibiotici quali Ampicillina. Il plasmide contiene inoltre un secondo gene codificante per un secondo fattore di resistenza, per un altro antibiotico, poniamo tetraciclina.
Nota, il plasmide verrà tagliato con l'endonucleasi specifica e potrà o meno incorporare l'inserto, avrai perciò plasmidi richiusi su se stessi e plasmidi ricombinanti.
A questo punto trasformi in un batterio che NON possieda ENTRAMBE le resistenze:
piastrerai i batteri in un terreno contenente tetraciclina e le colonie che si formeranno saranno soltanto quelle colonie che sono state trasformate con il plasmide (non sai se ricombinante o meno).
A questo punto ti resta, perciò, da scoprire, se portano o meno i tuoi mostriciattoli l'inserto, ossia se hanno incorporato il plasmide ricombinante o quello richiuso. Per fare ciò un tempo si faceva un "replica plating", ossia si poggiava un panno di velluto, sulla piastra, di modo tale che per contatto parte dei batteri si trasferisse sul tessuto e questo veniva poi messo a contatto con una nuova petri dish, questa volta contenente terreno con ampicillina. I batteri vengono così trasferiti dalla prima piastra (con Tetraciclina) ad una seconda (con Ampicillina): si formeranno solo quelle colonie contenenti un plasmide non ricombinante, in quanto solo queste possiedono il gene di resistenza all'ampicillina integro. Adesso, per confronto, ti è possibile riconoscere le colonie contenenti il plasmide con l'inserto: saranno quelle cresciute solamente nella piastra di Tetraciclina.

Questa strategia, molto macchinosa, è oggi superata: si preferisce ormai ricorrere a plasmidi che rechino geni di letalità, ossia i cui prodotti sono tossici per il batterio (comme Ccd B, un inibitore della girasi batterica), dotati al loro interno del MCS (Multiple Cloning Site). Il perché è semplice: qualora l'inserto viene ligato, il gene di letalità sarà non più funzionale, e perciò le cellule trasformate saranno capaci di crescere in coltura. Qualora invece il plasmide si richiuda su se stesso, i batteri riceventi moriranno a causa della produzione di un prodotto tossico.
Ovviamente anche in questo caso il plasmide mantiene un gene di resistenza ad antibiotico, di modo tale da distinguere i batteri trasformati con plasmide ricombinante da quelli non trasformati.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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fantastik84
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Inserito il - 11 giugno 2011 : 19:56:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fantastik84 Invia a fantastik84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie..cerco di ragionarci un pò su!!!
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 22:54:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da fantastik84

Grazie..cerco di ragionarci un pò su!!!



Prego, se hai domande postale pure, ben lieto(i) di rispondere

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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fantastik84
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 19 giugno 2011 : 08:53:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fantastik84 Invia a fantastik84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vi volevo ringraziare per l'aiuto datomi...l'esame è andato benone. Alla prossima
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