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Geeko
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Ctenophor1.0
Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 13 giugno 2011 : 18:54:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho già dato un'occhiata ai tanti topic che trattano i metodi di sequenziamento a livello genomico con sequenziamento gerarchico e con shotgun; vorrei solo chiedervi se quello che scriverò è corretto o meno, ho bisogno di una semplice conferma su quello che ho capito!
Vi metto un (*) in particolare nei punti dove ho più dubbi.

Sequenziamento gerarchico (innanzitutto la dicitura è corretta? o è meglio definirlo "shotgun gerarchico"?): Il genoma di partenza, o anche solo un cromosoma di esso, viene frammentato per sonicazione o con enzimi di restrizione* fino ad ottenere grandi frammenti (50-200kb) che vengono così inseriti in vettori da clonazione come BAC che una volta trasformati in batteri ospiti daranno vita ad una biblioteca genomica di grandi frammenti (che verranno così amplificati).
Si passa così ad "ordinare" i precedenti lunghi inserti per ottenere la stessa sequenzialità propria del cromosoma originale; questo viene realizzato tramite algoritmi informatici che confrontano le sequenze delle estremità di ogni frammento con le altre estremità in "overlap" con altri frammenti (contigs)*. Questo consente di ottenere una mappa fisica del cromosoma, utile per i passaggi seguenti. Non tutti gli inserti saranno utili a tale fine, infatti verranno selezionati solo quelli per comporre un "minimal tiling path" *(questa "scelta" è sempre affidata a strumenti informatici? e si basa sempre sulle sequenze alle estremità dei frammenti?).
La penultima fase comprende uno shotgun dei frammenti così scelti, ovvero la loro frammentazione random in corte sequenze ora facilmente sequenziabili. Non rimane ora che inserire i dati così ottenuti in un software apposito che ci fornirà la sequenza globale "più probabile" tenendo anche conto della provenienza di ogni cluster di piccoli frammenti sequenziati (in base alla precedente mappa fisica).
*E' giusto parlare in questo caso di cromosome walking? E mi potreste riassumere il suo concetto?

Shotgun (ha altri nomi?): in questo caso il genoma di partenza viene direttamente frammentato a random *(con sonicazione?) fino ad ottenere piccoli frammenti già sequenziabili. Questi frammenti vengono inseriti in vettori *(quali? anche semplici plasmidi?) per la loro amplificazione. Si passa al loro sequenziamento *(con quale metodo? anche la semplice variante di Sanger dei ddNTPs con basi pigmentate e lettura laser?). L'ultimo passo è ancora il riassemblamento con algoritmi informatici dei frammenti su base delle sequenze contigs che porta ad una sequenza globale dell'intero cromosoma *(o genoma?)

Ci ho capito qualcosa o sono da rilegare?

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 14 giugno 2011 : 16:12:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non è che mi aspetto una trattazione di ogni singolo asterisco che ho infilato nella descrizione...ma neanche un'opinione? O almeno ditemi se ho fatto errori madornali!
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 15 giugno 2011 : 20:43:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nessuna buon anima per una risposta?
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Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1042 Messaggi

Inserito il - 25 giugno 2011 : 19:07:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non vorrei spammare qui, ma davvero non c'è nessuno che mi possa dare una miniconferma che non sono totalmente nel mondo della fantascienza??
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