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Autore Discussione  

valeriamassa
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: milano


64 Messaggi
Inserito il - 04 novembre 2006 : 17:11:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valeriamassa  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valeriamassa Invia a valeriamassa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho provato a clonare il mio c-dna nel vettore di espressione di lievito pyex-bx, linearizzando il vettore con ecorI ed excidendo il mio c-dna dal vettore pcr 2.1 sempre con ecorI. Ho poi defosforilato il vettore pyex-bx linearizzato con la fosfatasi alcalina della neb per evitare che si richiudesse su se stesso. Quando ho fatto la ligazione usando la quick ligasi, trasformato le cellule competenti top10 il giorno dopo non era cresciuta NESSUNA COLONIA!!! Qualcuno sa spiegarmi dove ho sbagliato??? Come posso fare a risolvere il problema??
valeria

AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi
Inserito il - 04 novembre 2006 : 17:32:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
teoricamente hai scritto tutto giusto ma cmq le info che hai dato non sono dettagliatissime! è difficile dare una risposta così! Poi magari ti absta ripeterlo ed andrà meglio!

ad esempio che concentrazioni hai usato (e in che rapporti)? poi ci possono essere tante altre variabili meramente tecninco-pratiche in gioco (UV, ligazione, trasformazione ad es...)

Dai non scoraggiarti se un clonaggio è andato male!
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valeriamassa
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: milano


64 Messaggi
Inserito il - 04 novembre 2006 : 17:52:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valeriamassa  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valeriamassa Invia a valeriamassa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Nella ligazione con la quick ligasi ho usato un rapporto molare di 3:1 (eccesso di inserto rispetto al vettore), la reazione è 5 minuti a temperatura ambiente e poi in ghiaccio. Non avendo 50 ngr di vettore a disposizione per la ligazione (di solito è la quantità consigliata) ho usato 21 ngr di vettore e circa 6 ngr di inserto. Puoi aiutarmi?
valeria
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valeriamassa
Nuovo Arrivato


Prov.: Milano
Città: milano


64 Messaggi
Inserito il - 04 novembre 2006 : 17:54:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di valeriamassa  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di valeriamassa Invia a valeriamassa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah dimenticavo, ho trsformato 4 microlitri dei profotti di ligazione nelle cellule competenti top10
valeria
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi
Inserito il - 04 novembre 2006 : 19:23:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma non hai effettuato nessun controllo in parallelo?
ad. es utilizzando un vettore di controllo (spesso lo vendono assieme alla cellule competenti)
oppure un controllo con solo il vettore senza inserito l'inserto?
Almeno così puoi cercare di capire meglio a che punto c'è stato il problema! Se il problema ad es è nella trasformazione!
Purtroppo come ti ha detto Alexo i problemi possono essere molti e la cosa migliore è andare per esclusione, e non scoraggiarti ma riprovare!!!
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Anyra
Utente Junior

Anyra

Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara


212 Messaggi
Inserito il - 08 novembre 2006 : 12:21:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Anyra Invia a Anyra un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ma il rapporto 3:1 dovrebbe essere 3 prodotto da clonare e 1 plasmide mi sembra..........ho controllato ci vuole più prodotto da clonare rispetto al plasmide....
Alcuni kit arrivano anche fino a 10 a 1..
Riprova con più inseto
Ti consiglio anche io un controllo per valutare l'efficenza delle cellule
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw
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fpotpot
Utente

Città: middleofnowhere


1056 Messaggi
Inserito il - 08 novembre 2006 : 18:52:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fpotpot Invia a fpotpot un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
e provare con una ligasi che agisce piu' lentamente?a volte la quick ligasi (che suppongo sia quella che ci mette mezz'ora a temperatura ambiente con me nn aveva funzionato,ma ti parlo di un anno fa nn ho perfettametne idea delle condizioni (mi sembra di aver usato una t4 ligasi che agiva a 16 gradi e la lasciavo overnight ma poi ho provato anche altre temperature)
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