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CIOCCOELI
Nuovo Arrivato
Prov.: Pisa
Città: PISA
9 Messaggi |
 Inserito il - 06 novembre 2006 : 12:24:33
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CIAO A TUTTI COLLEGHI!!
VISTO E CONSIDERATO CHE NN MI AVETE AIUTATA SUL DIFFERENT DISPLAY..POTETE DARMI DELLE CHIARIFICAZIONI SUL METODO DEL DUAL BAITS(ARTICOLO Ilya Serebriiskii, Vladimir Khazak‡, and Erica A. Golemis§,JBC,1999).
NON RIESCO A CAPIRE IN PRATICA PERCHè SI è FATTO E PERCHè DICONO CHE SIA COSì IMPORTANTE E UTILE (RISPETTO MAGARI AL DOPPIO IBRIDO).
INOLTRE SEMPRE RIMANENDO IN TEMA, QUALCUNO DI VOI CONOSCE IL REVERSE TWO HYBRIDS???
SONO TUTTE METODOLOGIE ALTERNATIVE AL DOPPIO IBRIDO..MA NN LE HO BEN CHIARE...AIUTATEMI..VOI!!
SALUTI
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ELISA DI BUGNO |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2006 : 19:43:42
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Mi spiace che la mia risposta sul differential display non ti sia stata d'aiuto: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2310
Ho cercato un po' velocemente in internet ma non sono riuscita a trovare niente che spieghi in modo chiaro il dual baits, ho trovato solo altri articoli come ad es. questo: http://www.genome.org/cgi/content/full/12/11/1785
ma non so se ti potrà charire le idee.
Posso dirti che è un sistema più completo e più versatile del two-hybrid in quanto puoi costriure esche (bait) diverse che si possono legare o meno alla tua preda (pray), puoi discriminare se la tua proteina (preda) interagisce solo con una specifica esca o no.
Spero che qualcuno più fresco di studi di me ti possa dare informazioni maggiori!  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 novembre 2006 : 00:03:05
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Dual bait
http://www.fccc.edu/research/labs/golemis/Dual_Bait.html
Essenzialmente è un 2 hybrid avanzato, che serve quindi a determinare l'interazione fra 2 proteine.
In pratica viene trasfettato una libreria di lievito con 4 costrutti, come vedi qui:
Puoi selezionare le cellule che esprimono ciascuno dei 4 costrutti in questo modo:
Leu2 si seleziona mettendo le cellule in terreno senza leucina,
lacZ si seleziona aggiungendo IPTG e XGal al terreno e vedendo le colonie blu
Lys2 si seleziona mettendo le cellule in terreno senza lisina,
gusA si seleziona come lacZ ma con XGluc invece di XGal.
Ok, ora tu hai due baits (esche) che fondi con i domini di legame al DNA di lexA e cI. Queste esche sono due proteine target. Ad es. diciamo che vuoi trovare il ligando della proteina A.
Le esche saranno A ed un'altra proteina, a seconda di quello che vuoi trovare.
Ad es. puoi mettere un'esca con A-lexA e una con B-cI, dove B è una proteina totalmente diversa da A.
Se un lievito cresce senza leucina e fa diventare blu il terreno con XGal, ma non cresce senza lisina e non fa diventare blu il terreno con XGluc hai trovato un target! Falsi positivi cresceranno senza leucina e senza lisina e faranno sempre diventare blu il terreno. I negativi non cresceranno senza Lys o Leu e avranno colonie bianche in entrambi i casi.
Un altra cosa che puoi fare è mettere A-lexA con A2-cI dove A e A2 sono proteine simili. In questo caso cerchi colonie che attivino tutti e 4 i costrutti e quindi crescono senza Leu e senza Lys e han colonie blu su X-Gal e X-Gluc. Se trovi un target di questo tipo puoi fare mutagenesi sito mirata e vedere quali regioni sono importanti x il legame selettivo con A o A2.
PS: scrivere in maiuscolo su Internet equivale a gridare... meglio evitare |
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