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 Strategia di purificazione di una proteina
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edo
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3 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2011 : 15:29:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edo Invia a edo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il testo dell'esame è questo:
Suggerire una strategia per esprimere e purificare (in forma nativa) la proteina nucleare p80 della Drosophila

La mia procedura a grandi linee sarebbe:
- banca dati e vado a ricavare il cDNA
- scelgo il sistema di espressione --> Baculovirus
- lisi
- chiarificazione del lisato

da qui in poi sorgono i dubbi... non so bene cosa devo fare...
Mia intenzione era quella di calcolare il P.I. della proteina e separarla tramite IEF e poi fare una cromatografia per affinità specifica per quella proteina a cui ho aggiunto un tag. E' completamente sbagliata questa procedura o ha un filo logico?

Nello svolgimento consigliato che ho io viene invece detto di fare una cromatografia per scambio ionico e poi un Western Blotting... ma il Western Blotting implica una SDS-Page e quindi una denaturazione E a me serve la proteina nella forma nativa

Chiedo lumi a chi ne sa di più di me!

0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

Città: Paris, VIIème arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 09 luglio 2011 : 18:04:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da edo

Il testo dell'esame è questo:
Suggerire una strategia per esprimere e purificare (in forma nativa) la proteina nucleare p80 della Drosophila

La mia procedura a grandi linee sarebbe:
- banca dati e vado a ricavare il cDNA
- scelgo il sistema di espressione --> Baculovirus
- lisi
- chiarificazione del lisato

da qui in poi sorgono i dubbi... non so bene cosa devo fare...
Mia intenzione era quella di calcolare il P.I. della proteina e separarla tramite IEF e poi fare una cromatografia per affinità specifica per quella proteina a cui ho aggiunto un tag. E' completamente sbagliata questa procedura o ha un filo logico?

Nello svolgimento consigliato che ho io viene invece detto di fare una cromatografia per scambio ionico e poi un Western Blotting... ma il Western Blotting implica una SDS-Page e quindi una denaturazione E a me serve la proteina nella forma nativa

Chiedo lumi a chi ne sa di più di me!



Ciao, non ho molto tempo (gli esami incombono anche per me) però sinceramente mi pare che il tuo procedimento di purificazione sia troppo carico, cioè eccessivo. Soprattutto passare attraverso una IEF, una tecnica estremamente difficile da ottimizzare e con grossi problemi di riproducibilità, per una purificazione mi pare insoddisfacente. Ancora di più se introduci un tag per cromat. d'affinità, che in teoria dovrebbe darti un buon grado di purificazione.

Per quanto riguarda il WB, solitamente è preceduto da SDS-PAGE, ma la combinazione non è obbligata ed esistono elettroforesi non-denaturanti.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 luglio 2011 : 00:54:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La risposta è molto semplice:
quando fai una cromatografia per purificare la tua proteina raccogli varie frazioni e vuoi sapere in quale delle tue frazioni é presente la proteina purificata, quindi uno dei metodi é caricare le frazioni su un gel, fare un SDS-PAGE e poi un WB, in questo modo identifichi la frazione ( o le frazioni) che contiene la tua proteina.

Fare una IEF comunque non ti servirebbe a molto perché poi avresti la proteina nel gel, molto meglio isolarla direttamente per rimato rafia dal lisato.
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edo
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 10 luglio 2011 : 10:48:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di edo Invia a edo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie mille a entrambi!
Mi avete chiarito il dubbio!
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