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edo
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 09 luglio 2011 : 15:29:14
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Il testo dell'esame è questo:
Suggerire una strategia per esprimere e purificare (in forma nativa) la proteina nucleare p80 della Drosophila
La mia procedura a grandi linee sarebbe:
- banca dati e vado a ricavare il cDNA
- scelgo il sistema di espressione --> Baculovirus
- lisi
- chiarificazione del lisato
da qui in poi sorgono i dubbi... non so bene cosa devo fare...
Mia intenzione era quella di calcolare il P.I. della proteina e separarla tramite IEF e poi fare una cromatografia per affinità specifica per quella proteina a cui ho aggiunto un tag. E' completamente sbagliata questa procedura o ha un filo logico? 
Nello svolgimento consigliato che ho io viene invece detto di fare una cromatografia per scambio ionico e poi un Western Blotting... ma il Western Blotting implica una SDS-Page e quindi una denaturazione  E a me serve la proteina nella forma nativa 
Chiedo lumi a chi ne sa di più di me!
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2011 : 18:04:19
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Citazione:
Messaggio inserito da edo
Il testo dell'esame è questo:
Suggerire una strategia per esprimere e purificare (in forma nativa) la proteina nucleare p80 della Drosophila
La mia procedura a grandi linee sarebbe:
- banca dati e vado a ricavare il cDNA
- scelgo il sistema di espressione --> Baculovirus
- lisi
- chiarificazione del lisato
da qui in poi sorgono i dubbi... non so bene cosa devo fare...
Mia intenzione era quella di calcolare il P.I. della proteina e separarla tramite IEF e poi fare una cromatografia per affinità specifica per quella proteina a cui ho aggiunto un tag. E' completamente sbagliata questa procedura o ha un filo logico?
Nello svolgimento consigliato che ho io viene invece detto di fare una cromatografia per scambio ionico e poi un Western Blotting... ma il Western Blotting implica una SDS-Page e quindi una denaturazione E a me serve la proteina nella forma nativa
Chiedo lumi a chi ne sa di più di me!
Ciao, non ho molto tempo (gli esami incombono anche per me) però sinceramente mi pare che il tuo procedimento di purificazione sia troppo carico, cioè eccessivo. Soprattutto passare attraverso una IEF, una tecnica estremamente difficile da ottimizzare e con grossi problemi di riproducibilità, per una purificazione mi pare insoddisfacente. Ancora di più se introduci un tag per cromat. d'affinità, che in teoria dovrebbe darti un buon grado di purificazione.
Per quanto riguarda il WB, solitamente è preceduto da SDS-PAGE, ma la combinazione non è obbligata ed esistono elettroforesi non-denaturanti. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2011 : 00:54:16
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La risposta è molto semplice:
quando fai una cromatografia per purificare la tua proteina raccogli varie frazioni e vuoi sapere in quale delle tue frazioni é presente la proteina purificata, quindi uno dei metodi é caricare le frazioni su un gel, fare un SDS-PAGE e poi un WB, in questo modo identifichi la frazione ( o le frazioni) che contiene la tua proteina.
Fare una IEF comunque non ti servirebbe a molto perché poi avresti la proteina nel gel, molto meglio isolarla direttamente per rimato rafia dal lisato. |
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edo
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 10 luglio 2011 : 10:48:42
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Grazie mille a entrambi! 
Mi avete chiarito il dubbio! |
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Strategia di purificazione di una proteina
Didattica
