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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
 Inserito il - 19 luglio 2011 : 21:23:36
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Salve, ultimamente sto avendo dei problemi inaspettati amplificando da plasmide.
Tempo fa ho amplificato da plasmide un frammento di 6kb, utilizzando una mix pfu+taq e un profilo push-up. Ho ottenuto una bella bandona intensa di 6kb senza tante schifezze.
A distanza di un mese e mezzo, ripeto l' amplificazione per PCR e ottengo una banda appena sotto il pozzetto seguita da un forte smear omogeneo per tutta la lunghezza della corsa...0_0
Ho quindi ripetuto l esperimento utilizzando la PFX50 (della invitrogen), ho mantenuto lo stesso profilo di PCR e di nuovo ho riottenuto banda appena sotto il pozzetto e un forte smear.
Considerando che la PFX è la prima volta che la uso, consigli? thx
ho visto che consigliano di farla lavorare a temperature dai 60 ai 68, io uso un annealing prima di 54 e poi di 58, ho lasciato 60 secondi per kb, quindi un elongation di 6 minuti. Consigliano inoltre di metterne 1ul per una miscela di 50ul, non sarà un pò troppa?
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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patri
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 13:00:29
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scusa ma... puoi spiegarmi cosa è un protocollo push up?
grazie |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2011 : 23:29:17
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| Sarebbe l opposto del profilo touchdown, per cui prima dai 1-2 cicli di annealing basso e poi la alzi di n gradi. |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 24 luglio 2011 : 23:26:57
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ma hai proprio bisogno di fare questo push up qui?
e se amplifichi con una Taq "scadente" a diverse T° di annealing e poi magari se hai il prodotto vedi qual'e' quella ideale e usi la Pfu ? ( riguardo la quantità dipende dall'attività che ha )
tanto stai amplificando da plasmide in teoria non dovresti averne di aspecifici, oppure amplifica su quello precedente se ce l'hai ancora |
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patri
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2011 : 08:44:00
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ho un termocycler Verity e una 9700 Applied, devo amplificare un pezzo di 16S batterico di circa 6000 bp. Con la Taq gold non sono mai riuscita ad amplificare più di 1700 basi. mi dite che programma devo utilizzare? mi sembra dalle vostre discussioni che voi amplificate senza problemi pezzi così grandi da plasmidi.
c'è qualcosa che sbaglio o che non sò.
grazie |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2011 : 09:24:32
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| la pfx è una proof reading (high fidelity)? Se la polimerasi è molto efficiente, potresti aver bisogno di usare molto meno di 60 secondi per kb nell'elongation (io ne uso una dove consigliano di usare 15-30 sec per kb). Se usi molto di piu', potresti avere problemi di aspecificità. |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2011 : 20:51:08
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
......e se amplifichi con una Taq "scadente" a diverse T° di annealing e poi magari se hai il prodotto vedi qual'e' quella ideale e usi la Pfu ? ( riguardo la quantità dipende dall'attività che ha )
A mio avviso provare ad amplificare 6kb solo con la taq non so quanto convenga, rischierei di avere una smierata di frammenti abortivi di tutte le lunghezze.
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"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2011 : 20:55:32
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
la pfx è una proof reading (high fidelity)? Se la polimerasi è molto efficiente, potresti aver bisogno di usare molto meno di 60 secondi per kb nell'elongation (io ne uso una dove consigliano di usare 15-30 sec per kb). Se usi molto di piu', potresti avere problemi di aspecificità.
si è una proof reading high fidelity, il tuo ragionamento è giusto, ci avevo già pensato anche io, tuttavia il datasheet consiglia di lasciare il rapporto 60s/kb per ottenere buone rese, e a me serve una resa buonissima. |
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Salvador.Dalì
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 25 luglio 2011 : 21:03:21
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Citazione:
Messaggio inserito da patri
ho un termocycler Verity e una 9700 Applied, devo amplificare un pezzo di 16S batterico di circa 6000 bp. Con la Taq gold non sono mai riuscita ad amplificare più di 1700 basi. mi dite che programma devo utilizzare? mi sembra dalle vostre discussioni che voi amplificate senza problemi pezzi così grandi da plasmidi.
c'è qualcosa che sbaglio o che non sò.
grazie
Amplificare 6kb da plasmide è molto diverso che amplificarlo da genomico, così a naso ti direi di fare una nested. fai i primissimi cicli a temperatura di annealing bassina e poi un nestaggio. Magari dicci qual è il tuo profilo di pcr e cosa ottieni.
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Salvador.Dalì
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Amplicone di 6kb
Didattica
