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roberta.s
Utente Junior

yeast
Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:01:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, ho una domanda più filosofica che tecnica sul clonaggio:)
Mi chiedo cosa diavolo ci sia nelle colonie in cui la ligation non va a buon fine.
Mi spiego:
1) ligation tra inserto e vettore. Quest'ultimo fornisce resistenza e non ha alcuna possibilità di ricircolarizzare (digerito con 2 enzimi non compatibili)
2) trasformazione e crescita su piastre LB+antibiotico
3) colonie su piastra, ma nessuna è positiva per il clonaggio

Dunque, la mia domanda è questa. Cosa c'è in quelle colonie? Posto che il DNA lineare viene subito espulso dai batteri e che i batteri sono privi di resistenza, per cui non crescono di per sè su LB+antibiotico.

Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:14:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il vettore circolarizzato privo di inserto?
poi non sono sicuro che il DNA lineare viene digerito, a volte i batteri fanno cose strane.
Fai una PCR sull prodotto di ligazione prima di trasformare, cosi' vedi se o meno la ligazione è avvenuta


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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:26:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Appunto, mi chiedo come ricircolarizza senza inserto se è stato digerito con 2 enzimi di restrizione diversi...
Comunque una cosa è certa: i batteri fanno cose strane!
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:27:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
istinto di sopravvivenza


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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:33:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s

Appunto, mi chiedo come ricircolarizza senza inserto se è stato digerito con 2 enzimi di restrizione diversi...
Comunque una cosa è certa: i batteri fanno cose strane!



Non sempre la doppia digestione è completa. Magari uno dei due enzimi taglia meno bene, e quindi hai una certa quantità di plasmide tagliato con un solo enzima: tanto basta per ri-circolarizzare e darti falsi positivi. Per questo consiglio sempre di defosforilare, anche se digerisci con due enzimi diversi.

P.S.: sei sicura che i tuoi enzimi non diano estremità compatibili, siano cioè isocaudameri?

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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:37:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
in realtà quando si estrae il frammento da gel (dopo digestione) credo che le molecole di plasmide non digerito con entrambi gli enzimi siano molto poche.
per quanto riguarda la compatibilità sono certa, anche perchè dopo verifica mediante estrazione di plasmide e digestione non ottengo nulla che somigli al plasmide senza inserto...percio' mi chiedevo cosa fosse!
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:58:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
beh, posso dirti che nonostante digestione, defosforilazione e purificazione da gel a volte mi ritrovo delle colonie (pochissime, 3-4) nella piastra del ctrl negativo (e nessuna in quella del negativo non trasformato). Per questo mi viene da pensare a qualche molecola di DNA digerita solo da un enzima (o magari nn digerita affatto).

Non ottieni nulla che sia il plasmide senza inserto? uhmmm... forse qualche contaminazione?

P.S.: vedo che sei a parigi :), io sono ad orsay!

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roberta.s
Utente Junior

yeast

Città: Parigi


564 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 18:18:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di roberta.s Invia a roberta.s un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Curie?
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 27 luglio 2011 : 18:59:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
CNRS

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