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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
 Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:01:08
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Ciao a tutti, ho una domanda più filosofica che tecnica sul clonaggio:)
Mi chiedo cosa diavolo ci sia nelle colonie in cui la ligation non va a buon fine.
Mi spiego:
1) ligation tra inserto e vettore. Quest'ultimo fornisce resistenza e non ha alcuna possibilità di ricircolarizzare (digerito con 2 enzimi non compatibili)
2) trasformazione e crescita su piastre LB+antibiotico
3) colonie su piastra, ma nessuna è positiva per il clonaggio
Dunque, la mia domanda è questa. Cosa c'è in quelle colonie? Posto che il DNA lineare viene subito espulso dai batteri e che i batteri sono privi di resistenza, per cui non crescono di per sè su LB+antibiotico.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:14:32
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il vettore circolarizzato privo di inserto?
poi non sono sicuro che il DNA lineare viene digerito, a volte i batteri fanno cose strane.
Fai una PCR sull prodotto di ligazione prima di trasformare, cosi' vedi se o meno la ligazione è avvenuta |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:26:18
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Appunto, mi chiedo come ricircolarizza senza inserto se è stato digerito con 2 enzimi di restrizione diversi...
Comunque una cosa è certa: i batteri fanno cose strane! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:27:48
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istinto di sopravvivenza  |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:33:25
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Citazione:
Messaggio inserito da roberta.s
Appunto, mi chiedo come ricircolarizza senza inserto se è stato digerito con 2 enzimi di restrizione diversi...
Comunque una cosa è certa: i batteri fanno cose strane!
Non sempre la doppia digestione è completa. Magari uno dei due enzimi taglia meno bene, e quindi hai una certa quantità di plasmide tagliato con un solo enzima: tanto basta per ri-circolarizzare e darti falsi positivi. Per questo consiglio sempre di defosforilare, anche se digerisci con due enzimi diversi.
P.S.: sei sicura che i tuoi enzimi non diano estremità compatibili, siano cioè isocaudameri? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:37:26
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in realtà quando si estrae il frammento da gel (dopo digestione) credo che le molecole di plasmide non digerito con entrambi gli enzimi siano molto poche.
per quanto riguarda la compatibilità sono certa, anche perchè dopo verifica mediante estrazione di plasmide e digestione non ottengo nulla che somigli al plasmide senza inserto...percio' mi chiedevo cosa fosse! |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 17:58:18
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beh, posso dirti che nonostante digestione, defosforilazione e purificazione da gel a volte mi ritrovo delle colonie (pochissime, 3-4) nella piastra del ctrl negativo (e nessuna in quella del negativo non trasformato). Per questo mi viene da pensare a qualche molecola di DNA digerita solo da un enzima (o magari nn digerita affatto).
Non ottieni nulla che sia il plasmide senza inserto? uhmmm... forse qualche contaminazione?
P.S.: vedo che sei a parigi :), io sono ad orsay! |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 18:18:27
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| Curie? |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2011 : 18:59:50
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