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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
 Inserito il - 28 luglio 2011 : 09:14:46
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Ho trasformato delle cellule di coli con un plasmide (che ho clonato):
ho trasformato 200microL di cellule competenti con 10microL di prodotto di ligazione (reazione in 50microL: 300ng di plasmide+50ng di inserto).
Ho spatolato poi 350microL delle cellule trasformate su piastre da 90mm.
Risultato: non vedo colonie...anche se mi sembra ci sia quasi una patina sulla piastra...(ho piastrato troppe cellule?)
N.B. Le cellule competenti le ho preparate con la metodica CaCl2 del Sambrook. La prima risospensione del pellet però invece di farla in 30ml di MgCl-CaCl2 l'ho fatta in 20ml. Può essere questo un fattore di distiurbo (non ho cellule competenti?).
Gli inserti di PCR invece avevano pochi nucleotidi a monte dei siti di restrizione: 1 a monte di un sito per SpeI e 3 a monte di un sito per NotI. Può darsi che non abbia tagliato bene l'inserrto e che la ligazione non sia venuta?
Si accettano suggerimenti.
Grazie
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gi |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 10:57:48
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In generale ti conviene piastrare meno cells sulle piastre, e comunque prova a fare delle diluizioni: io di solito piastro 200 uL, 100uL e 10uL(in 100uL di LB).
Che kit hai usato per la ligation? Sei sicura che il volume finale della reazione debba essere 50 uL e non 10?
Non so suggerirti qualcosa di preciso sulle cell competenti preparate in questo modo, perchè io preparo cellule elettrocompetenti. Ad ogni modo, ogni volta che prepari nuovi batteri competenti devi testarne la competenza trasformandoli con un plasmide (meglio se commerciale).
PS: per la ligation, io trovo che la quantità totale di DNA nella reazione non debba eccedere i 100 ng: troppo DNA disturba la ligasi. Una volta terminata la ligation, hai purificato il prodotto? Io lo precipito in etanolo, risospendo il pellet in 7 uL e trasformo con 3 uL. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 11:00:19
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| PPS: quando inserisci un sito di restrizione durante una PCR all'estremità del frammento, aggiungi 6 nt a monte del sito (CGGCCG) |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 11:09:20
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Intanto posso suggerirti di inserire più nucleotidi a monte di ogni sito di restrizione: la regola generale è di metterne 3-4 rima di ogni sito (ma alcuni enzimi lavorano meglio con più nucleotidi).
Inoltre, le ligasi che uso io (ne ho usate almeno tre differenti) vanno usate in un volume finale di 20 ul, tu hai un vol finale di 50 ul, non so se questo possa aver influito negativamente sulla tua reazione. Tieni conto che (ho letto da qualche parte nn ricordo dove) non dovresti superare i 100-150 ng di quantità di DNA totale (plasmide + inserto) soprattutto quando trasformi perchè invece di avere + colonie, hai l'effetto opposto (troppo DNA nella trasformazione inibisce la trasformazione stessa). Non credo comunque che sia questo il tuo caso, perchè trasformi con 10 ul di una reazione 50 ul contenente 350 ng totali. Quindi trasformi con 70 ng (un po' sopra la norma, ma nn penso cosi' eccessivi).
Infine, mi interessa il punto in cui asserisci di vedere una sorta di patina: potrebbe essere che le tue piastre non funzionano, nel senso l'antibiotico contenuto è andato, e quindi crescono batteri non trasformati. A me è capitato due volte perchè la tecnica che preparava le piastre usava una kanamicina ormai deperita. Se la patina è costituita da batteri te ne accorgi perchè la iastra puzza (il caratteristico odore dei batteri).
Saluti |
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Livia89
Nuovo Arrivato
9 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 15:40:49
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Il suggerimento che posso darti io, per esperienza personale, è di ridurre il quantitativo di ligation product che usi per la trasformazione. A fronte del tuo volume finale di 50microL ti consiglio di usare 5microL invece che 10 per la trasformazione.
Inoltre anche io, come roberta.s, ti consiglio di piastrare differenti volumi di cellule. Di solito piastro 50microL e 150microL.
Saluti
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 17:24:28
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
Infine, mi interessa il punto in cui asserisci di vedere una sorta di patina: potrebbe essere che le tue piastre non funzionano, nel senso l'antibiotico contenuto è andato, e quindi crescono batteri non trasformati. A me è capitato due volte perchè la tecnica che preparava le piastre usava una kanamicina ormai deperita. Se la patina è costituita da batteri te ne accorgi perchè la iastra puzza (il caratteristico odore dei batteri).
Saluti
Spemann se hai il bianco pulito sicuramente non è l' antibiotico, per tutto il resto quoto in pieno.
Quanto gli dai di precrescita? |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2011 : 18:43:46
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| sono d'accordo con te Zerhos, ma jovy non menziona alcun bianco quindi o nn è stato fatto o il risultato è simile a quello del campione trasformato col clonaggio |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2011 : 09:45:52
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Inanzitutto ringrazio tutti per gli utili consigli.
->per roberta.s: ho usato la ligasi T4 della promega. La reazione suggeritami dal data sheet è su un volume di reazione di 10microL, però io ho proporzionato il tutto alle quantità di materiale che ho usato...non pensavo che la ligasi avesse problemi su quntità elevate di materiale. La reazione che ho impostato è stata la seguente:
225ng di vettore,
37.5ng di DNA
2unità di T4 ligasi
buffer
H2O a 50microL.
Il tutto 4h a 15°C.
Dopo la ligazione non ho purificato.ù
-> per SpemannOrganizer:
anche io avevo pensato fossero batteri, ma:
- ho piastrato un controllo, cioè 100microL di cellule trasformate su un terreno senza antibiotico e la patina e l'odore sono stati ben diversi;
- ieri ho fatto una PCR su una ansata di patina (che mi amplificano nel sito di insersione del plasmide) e non ho avuto bande;
-> per lina:
ho trasformato anche in parallelo con 5microL di ligation, stesso risultato.
-> per zerhos:
precrescita? prima di piastrare ho incubato 1h a 37°C.
Ieri ho anche fatto una PCR sul prodotto di ligation...Risultato? Plasmide senza inserto.
Il punto è che ho digerito il plasmide con due enzimi di restrizione e che ho anche defosforilato prima della ligazione.
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gi |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2011 : 11:39:54
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Per la ligation con kit promega: non far avvenire la reazione in un volume maggiore di 10 uL, e prova un'incubazione a 4°C overnight.
225 ng di vettore sono troppi. Prova una quantità di vettore compresa tra 30ng e 50ng, tenendo conto che la quantità totale di DNA (vettore+inserto) è meglio non superi i 100 ng.
Che rapporto vettore/inserto hai usato? Prova rapporti differenti. Io uso vettore:inserto=1:3, =1:5 e =1:10 (trovo che 1:5 sia il migliore).
In bocca al lupo! |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2011 : 10:01:15
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grazie roberta s.
sto riorganizzandomi una ligazione.
Quindi mi consigli ad esempio di trasformare 30ng di vettore con 90ng di DNA...(rapporto 1:3)
Solo che anche in questo caso supero i 100ng...
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gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2011 : 11:10:08
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il rapporto che si usa nelle ligation è un rapporto molare. Ti vengono 90 ng di inserto solo se l'inserto in questione è uguale in lunghezza al vettore, altrimenti devi determinarti la quantità di inserto da usare attraverso la formuletta : [ratio X (bp inserto/bp vettore) X ng di vettore usato]. Se per esempio usi un ratio di 1:3, con vettore di 3000 bp e inserto di 1000 bp, e una quantità di vettore pari a 30 ng, allora la formula sarà: 3 X (1000/3000) X 30 ng.
Se superi i 100 ng di poco nn fa nulla, generalmente ci si tiene sui 100-150 ng di DNA totale. |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2011 : 12:26:37
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si', infatti anche se superi un po' i 100 ng non fa niente.
La formula che devi usare per calcolare il rapporto molare tra due frammenti di DNA è:
(ng vettore x kb inserto) / kb vettore x ratio (inserto/vettore) = ng inserto
Es.: vettore 5kb e inserto 2kb in rapporto 1:5
(30 ng x 2 kb) / 5 kb x 5/1 = 60 ng
quindi metti 30 ng vettore e 60 ng inserto nel tubo e fai avvenire la ligation
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 02 agosto 2011 : 13:11:03
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grazie tutto più chiaro!
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gi |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 30 agosto 2011 : 18:00:26
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Ragazzi...
ho ripetuto la ligazione riducendo il volume di reazione a 10microL e trasformando con 5microL di questa miscela...
Risultato ? Le cellule sono cresciute...Ho fatto una PCR di controllo su due colonie per plasmide(ne avevo 2) e mi è risultato in tutti e 4 i casi il plasmide wt...
Ho proceduto xcon una PCR sul prodotto di ligazione...stesso risultato...
quindi non ho ligato niente!
Dopo digestione il plasmide era lineare e vedevo un'unica banda...Ho tagliato con una coppia di enzimi di restrizione (Spe e Not)...quindi il plasmide non può aver self ligato...Mi sbaglio?
Non riesco a capire dove possa essere l'errore e come procedere...
consigli? chiedetemi dei dettagli se necessario... |
gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 30 agosto 2011 : 21:40:23
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| che rapporti molari usi? quuantità DNA vettore e inserto?hai provato a variare le concentrazioni? quanto tempo per la ligation? |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 09:22:02
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ho usato un rapporto vettore:inserto=1:3...e ho fatto la ligation 4h a 15°C...
il fatto che abbia il vettore tagliato su due siti diversi non mi evita la circolarizzazione dello stesso senza inserti?
quindi modifico le condizioni...
cosa ne pensi se faccio una ligation a 4°C o.n.?
oppure devo variare la digestione?
potrebbe essere anche li il problema?
il plasmide dopo digestione è lineare...però tra i due siti di restrizione ci sono solo 7bp...quindi non possso sapere se la digestione è completa o meno... |
gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 12:01:55
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Dovrebbe evitare, è chiaro, ma se ha ricircolarizzato è probabile che abbia tagliato solo uno dei due enzimi. Hai tagliato con entrambi gli enzimi allo stesso tempo? il buffer era compatibile con entrambi (cioè permetteva una efficienza di reazione del 100% o meno?)? Potrebbe essere che uno degli enzimi nn taglia efficientemente, o in alternativa uno degli enzimi potrebbe essere scassato. In effetti, avendo solo 7 bp tra un sito e l'altro, non sei in grado di dire se hai tagliato entrambi i siti o meno. A tal proposito potresti allestire delle singole digestioni in parallelo, utilizzando la stessa quantità di DNA e le stesse unità di enzima che usi nella doppia digestione (e lo stesso buffer), per valutare l'efficienza dei tuoi enzimi.
Inoltre quanto DNA digerisci e quante unità di ogni enzima usi? Quanto tempo le tieni alla T indicata? Io li tengo a volte anche 3-4h... Infine, ti suggerisco anche di defosforilare il vettore dopo la digestione.
Per la ligation: Perchè 4 h a 15 °C? Meglio 1 o 2 h a R.T. no? Generalmente per le sticky ends 1 o 2 h a r.t. sono + che sufficienti, ma se fai over night va piu' che bene (io pero' userei 16°C, non 4).
Cerca di rispondere alle domande che ti ho fatto, proverò a esserti + di aiuto
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 12:34:45
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ho tagliato insieme con i due enzimi...
ho usato il buffer di uno dei due enzimi che ha efficienza 75-100% con l'altro.
ho digerito 1microg di plasmide con 6 unità di ogni enzima e 200ng di inserto con 1.7unità di ogni enzima (0.17microL...un pò difficili da prelevare). ho incubato 4h a 37°C.
Avevo già provato ad allestire una digestione parallela con l'enzima 2 e il buffer dell'enzima 1 /(quello migliore) per 2h a 37°C e avevo avuto una digestione incompleta di poco...come mi accadeva anche per l'enzima 1 con il suo buffer...per questo avevo allungato i tempi a 4h...Con queste condizioni però non ho ricontrollato l'efficienza della reazione...anche perchè altre trasformazioni mi sono venute (con gli stessi enzimi e plasmidi diversi).
Ho pensato di digerire nuovamente o.n. a 37°C sia il plasmide che gli inserti.
Cosa ne pensi?
Grazie! |
gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 12:58:36
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hai fatto bene ad allungare i tempi, sinceramente credo che a questo punto non dovresti avere problemi ma, ovviamente se controlli è meglio. Una digestione o.n. puo' essere indicata in questi casi, pero' assicurati che non ci sia star activity da parte dei due enzimi (e adegua il volume di reazione, quantità DNA ed enzimi per una reazione o.n.).
Da parte mia credo che sia qui il problema, nella digestione del plasmide.
Del resto, usi una quantità irrisoria di inserto (e ancora di piu' di enzima). Io generalmente utilizzo tutto l'inserto amplificato dalla pcr con una adeguata quantità di enzimi, sempre in eccesso. Forse sarò un po' sprecone, ma facendo cosi' non ho quasi mai fallito un clonaggio. Del resto immagino che dopo la digestione purifichi il tuo inserto, giusto? E se ne digerisci 200 ng, e poi purifichi quanto te ne rimane??
Fammi sapere
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 13:30:34
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ma cosa è la star actity?
e perchè devo variare i volumi per una reazione o.n.?
non posso usare gli st6essi di una fatta 4h? |
gi |
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jovy
Nuovo Arrivato
102 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 14:09:08
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ne recupero di DNA minimo la metà...quindi almeno 100ng...considerato che poi ne ligo 12ng può andare bene?
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gi |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 31 agosto 2011 : 16:05:19
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la star activity è quando l'enzima si comporta "aspecificamente", cioè taglia siti simili al sito di restrizione canonico o addirittura perde totalmente specificità. Questo accade spesso quando prolunghi troppo una reazione di digestione: per esempio l'acqua della soluzione, evaporando, fa concentrare sali e glicerolo contenuti nel buffer, alterando le condizioni ottimali a cui l'enzima deve lavorare. Ci sono enzimi che hanno una certa tendenza alla star activity, altri invece considerevolmente meno. Io in genere utilizzo la over night per tagliare 5 ug di DNA in un volume non inferiore a 70-80 ul. Dal momento che la digestione è prolungata (o.n. per l'appunto) puoi anche utilizzare meno unità di enzima, risparmiando quindi qualcosa. Non faccio spesso digestioni o.n. però, proprio per evitare problemi di star activity.
Se riesci a recuperare 100 ng di DNA mi pare buono, ma utilizzi colonne? o precipitazione? Qualunque metodo utilizzi comunque hai sempre una notevole perdita, quindi ti consiglierei di digerire + inserto (tra l'altro, poi come lo quantifichi?).
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