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 PLASMID RESCUE
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nettola
Nuovo Arrivato

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Città: lecce


26 Messaggi

Inserito il - 16 agosto 2011 : 14:26:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di nettola Invia a nettola un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti! nei miei appunti c'è scritto che il DNA introdotto per trasformazione può essere mantenuto nel nuovo organismo integrandosi in un plasmide preesistente. Per fare ciò però si usa come metodo di trasformazione il "plasmid rescue". perchè? e in che cosa consiste il "plasmid rescue"?

nettola

SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 16 agosto 2011 : 14:59:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mah, io per plasmid rescue conosco questa tecnica:
si fa integrare un plasmide linearizzato (magari contenente alle sue estremità siti di riconoscimento per trasposasi) in un DNA genomico ospite. Questo vettore contiene anche un sito unico di restrizione,ad esempio EcoRI, quindi presente una sola volta nel plasmide. Una volta avvenuta l'integrazione, si digerisce il DNA genomico estratto con EcoRI. Successivamente si utilizza la ligasi, per "incollare" i vari frammenti di DNA ottenuti: cosi' facendo, promuoverai la formazioni di tanti circoletti, cioè di tante molecole circolari di DNA.
Infine si trasforma E. coli con questo DNA circolare ottenuto in vitro: solo il DNA contenente il plasmide originario (provvisto di resistance gene e di origine di replicazione) piu' l'eventuale sequenza genomica che si porta appresso, sarà in grado di promuovere la formazione di colonie batteriche.

P.S.: anche se EcoRI è contenuto una sola volta nel plasmide, il sito è probabilmente presente innumerevoli volte nel DNA genomico. La digestione con questo enzima promuoverà quindi l'escissione del plasmide con una sequenza + o - lunga di genomico fiancheggiante il plasmide nel sito in cui si era integrato. Questo puo' essere utile per clonare e identificare (tramite sequenziamento) sequenze regolatrici come enhancer o promotori o ancora geni.

Allego una immagine carina e molto informativa
http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n10/fig_tab/nrg1001-756a_F4.html#figure-title

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