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rossana84
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5 Messaggi
Inserito il - 08 settembre 2011 : 19:13:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rossana84 Invia a rossana84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti. Ho bisogno del vostro aiuto!!!! Sono due mesi che provo a clonare un esone del CFTR wt per una variazione di sequenza senza ottenere risultati. Utilizzo un vettore chiamato pTB. Faccio tutte le prove con la ligazione ( rapporto inserto vettore). Poi faccio la trasformazione e non ottengo nulla ( 2 colonie in 6 piastre di Petri). Le cellule competenti le preparo io ma ovviamente le ho provate prima di utilizzarle. ricordo che il mio inserto lo eluisco da gel, e poi lo utlizzo per la ligazione. Questo protocollo lo già adottato in precedenza con ottimi risultati. Mi sapete aiutare??? Grazie a chi mi risponderà!!!

rossana84
Nuovo Arrivato



5 Messaggi
Inserito il - 08 settembre 2011 : 19:20:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rossana84 Invia a rossana84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
p.s la tecnica è quella delo splicing functional assay!!! se qlc di voi la conosce o la utilizza risponda per favore!!! Grazie sono dispearata
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giulella
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38 Messaggi
Inserito il - 09 settembre 2011 : 09:24:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di giulella Invia a giulella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai provato a utilizzare un controllo positivo per la ligazione e la trasformazione?
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rossana84
Nuovo Arrivato



5 Messaggi
Inserito il - 09 settembre 2011 : 15:49:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di rossana84 Invia a rossana84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In che senso?? No in realtà no... non mi hanno mai detto di farlo in lab!!! Cosa può essere andato storto???
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giulella
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38 Messaggi
Inserito il - 12 settembre 2011 : 08:53:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di giulella Invia a giulella un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Di solito nel kit che uso (PGEM easy vector promega) è incluso un controllo positivo (DNA) su cui fai ligazione e trasformazione insieme agli altri campioni.
Se anche nel controllo positivo non ottengo colonie vuol dire che qualcosa è andato storto nella trasformazione o nella ligazione
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