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MaryAngel
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Inserito il - 10 settembre 2011 : 14:03:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MaryAngel Invia a MaryAngel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!!! sono nuova del forum...avrei qualche domandina da porvi!!Non so se ne avete già discusso cmq ora vi spiego.....
In questi giorni mi sto dedicando all'esecuzione di quantificazioni relative in real time.
per l'esatezza sto confrontando cDNA di una mammella di pecora sana negativa a infiammazione linfoproliferativa da Visna Maedi) e cDNA di mammelle malate. Ho 15 geni da testare. Sto utilizzando due housekeeping per normalizzare: la beta-actina e il 18S.
Il deltact tra il gene d'interesse e ciascuno dei due housekeeping è molto diverso. varia per esempio da 40 per il 18S a 400 con la beta actina.Dovrei fare la media tra i due ma mi sembrano valori troppo distanti. è possibile che per la stessa mammella il valore dell'hosekeeping sia così diverso. il divario tra i due si accentua quando confronto mammelle "molto positive" e i valori di beta actina cambiano molto facendomi pensare che la beta actina non sia un buon housekeeping per questo esperimento, come se la sua espressione cambiasse nel tessuto infiammato rispetto a quello sano. Inoltre per la retrotrascrizione sono partita da mRNA ottenuto con Kit qiagen non da RNA totale dunque non ho potuto quantificare realmente ciò che stavo retrotrascrivendo.é un problema?? spero di essermi spiegata!!!scusate se vi tempesto di domande!!!ho paura che i dati siano strani perchè la mia mano non è precisa!!!cmq i triplicati sono venuti piuttosto bene!!!!ehehe che stress la real time!!

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2011 : 16:22:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si ne abbiamo discusso parecchie volte in effetti, se utilizzi la funzione cerca del forum troverai varie discussioni in proposito.
La scelta degli HK come ho spiegato più volte non è del tutto banale, bisogna fare una scelta oculata e testare gli HK "prima" di passare agli esperimenti, trovi tutto spiegato in varie discussioni.
Nel tuo caso probabilmente entrambi gli HK che hai scelto sono sbagliati!
La b-actina è possibile che vari nel tessuto infiammato, il 18S sicuramente è più stabile ma è un RNA ribosomiale, se tu hai utilizzato mRNA e non RNA totale non dovresti neanche averlo nei tuoi campioni.
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MaryAngel
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2011 : 18:39:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di MaryAngel Invia a MaryAngel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ti ringrazio!!!!Immaginavo che la beta-actina non andasse bene, ma non avevo valutato il problema del 18S.Sta di fatto però che il mio 18S amplifica ed esce a ct buoni.Rrobabilmente l'arrichimento in mRNA da Rna totale del Kit non riesce benissimo!!
grazie ancora per aver messo a disposizione le tue conoscenze e competenze
a presto!!
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