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Discussione

MaryAngel
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2011 : 14:03:26

Ciao!!! sono nuova del forum...avrei qualche domandina da porvi!!Non so se ne avete gi� discusso cmq ora vi spiego.....
In questi giorni mi sto dedicando all'esecuzione di quantificazioni relative in real time.
per l'esatezza sto confrontando cDNA di una mammella di pecora sana negativa a infiammazione linfoproliferativa da Visna Maedi) e cDNA di mammelle malate. Ho 15 geni da testare. Sto utilizzando due housekeeping per normalizzare: la beta-actina e il 18S.
Il deltact tra il gene d'interesse e ciascuno dei due housekeeping � molto diverso. varia per esempio da 40 per il 18S a 400 con la beta actina.Dovrei fare la media tra i due ma mi sembrano valori troppo distanti. � possibile che per la stessa mammella il valore dell'hosekeeping sia cos� diverso. il divario tra i due si accentua quando confronto mammelle "molto positive" e i valori di beta actina cambiano molto facendomi pensare che la beta actina non sia un buon housekeeping per questo esperimento, come se la sua espressione cambiasse nel tessuto infiammato rispetto a quello sano. Inoltre per la retrotrascrizione sono partita da mRNA ottenuto con Kit qiagen non da RNA totale dunque non ho potuto quantificare realmente ci� che stavo retrotrascrivendo.� un problema?? spero di essermi spiegata!!!scusate se vi tempesto di domande!!!ho paura che i dati siano strani perch� la mia mano non � precisa!!!cmq i triplicati sono venuti piuttosto bene!!!!ehehe che stress la real time!!

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2011 : 16:22:06

Si ne abbiamo discusso parecchie volte in effetti, se utilizzi la funzione cerca del forum troverai varie discussioni in proposito.
La scelta degli HK come ho spiegato pi� volte non � del tutto banale, bisogna fare una scelta oculata e testare gli HK "prima" di passare agli esperimenti, trovi tutto spiegato in varie discussioni.
Nel tuo caso probabilmente entrambi gli HK che hai scelto sono sbagliati!
La b-actina � possibile che vari nel tessuto infiammato, il 18S sicuramente � pi� stabile ma � un RNA ribosomiale, se tu hai utilizzato mRNA e non RNA totale non dovresti neanche averlo nei tuoi campioni.

MaryAngel
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 10 settembre 2011 : 18:39:01

Ti ringrazio!!!!Immaginavo che la beta-actina non andasse bene, ma non avevo valutato il problema del 18S.Sta di fatto per� che il mio 18S amplifica ed esce a ct buoni.Rrobabilmente l'arrichimento in mRNA da Rna totale del Kit non riesce benissimo!!
grazie ancora per aver messo a disposizione le tue conoscenze e competenze
a presto!!