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 Biologia Molecolare
 espressione proteine plasmidi con IRES
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Donde
Utente Junior

biohazard


272 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2011 : 14:23:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Donde  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Donde Invia a Donde un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao, avrei bisogno di sapere una cosa. supponiamo di avere un plasmide che contiene il gene per una certa proteina X. a monte di questo gene c'è un promotore che ne controlla l'espressione, mentre a valle c'è una sequenza IRES (sito interno di entrata al ribosoma) seguita a sua volta da una sequenza codificante per la proteina reporter eGFP. trasfettando cellule eucariotiche con questo plasmide, e ammettendo che il promotore a monte della proteina X sia attivato, come vengono espresse le due proteine? la proteina X risulta fusa a eGFP? oppure eGFP viene tradotta separatamente e quindi è presente come proteina separata?

grazie mille dell'aiuto! ;)

"DNA just is. And we dance to its music."

Geeko
Utente

Ctenophor1.0

Città: Milano


1043 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2011 : 15:17:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Geeko Invia a Geeko un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non ne so molto nello specifico, ma ragionandoci sopra direi che dipende da due cose fondamentalmente, cioè la presenza/assenza di tripletta stop intergenica, e affinità dei ribosomi per la regione 5' e per la sequenza IRES.
Cioè, innanzitutto se hai una tripletta STOP alla fine del tuo "geneX" ovviamente non otterremo mai la proteina di fusione, ma due proteine separate.
Nel caso questa non ci sia, credo che si assista alla sintesi sia della proteina di fusione (X-GFP) che della sola GFP, con un rapporto che credo dipenda dalla affinità delle subunità minori dei ribosomi per i due siti di riconoscimento, cioè rispettivamente la regione 5' (da cui poi la subunità inizia a scorrere fino a trovare l'inizio traduzione) e la sequenza IRES. Ma non credo si ottenga un 100% netto dell'uno o dell'altro prodotto.
Ma sono solo ragionamenti, bisognerebbe lavorare sull'argomento.
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


955 Messaggi

Inserito il - 16 settembre 2011 : 14:36:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Come ti ha detto Geeko, il primo gene, quello a monte, deve contenere anche un codone di stop, altrimenti se tu l'omettessi, otterresti una proteina di fusione. Il che non avrebbe senso con una IRES a valle, che è usata proprio per ottenere due proteine separate a partire da un unico mRNA: essa fornisce infatti un sito interno per la traduzione, di modo che contemporaneamente verrano tradotti il gene a monte (che avrà il Cap e sequenza Kozak, e il gene a valle grazie alla presenza di questa IRES

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Donde
Utente Junior

biohazard



272 Messaggi

Inserito il - 16 settembre 2011 : 15:24:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Donde  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Donde Invia a Donde un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie per le risposte :) anche io, ragionandoci un po' su, penso che le due proteine dovrebbero essere separate.. solo che io sono solo uno studente, e vedo che altre persone molto più esperte analizzano i risultati come se le due proteine fossero fuse, quindi pensavo che almeno in parte fosse così

"DNA just is. And we dance to its music."
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wunzettina
Nuovo Arrivato



2 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2011 : 00:23:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di wunzettina Invia a wunzettina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
in realtà la sequenza IRES di solito si utilizza quando vuoi esprimere contemporaneamente due proteine. Questi plasmidi sono fatti in modo tale che venga espresso il tuo gene "X" e contemporaneamente la GFP che fa da reporter. Se vedi espressione di GFP puoi essere confidente del fatto che il tuo gene è espresso...sempre che tu abbia clonato correttamente il gene "x". In ogni caso è necessario che nella sequenza del tuo gene x ci sia uno stop se vuoi che questa venga espressa senza "aggiunte". Per creare delle proteine di fusione di solito si utilizzano vettori che hanno la GFP (o HA o altri tag) e a monte/valle di questa il multiple cloning site (dove trovi i siti di clonaggio). Ma i siti di clonaggio sono disposti in modo tale da mantenere il frame corretto. Anche in questo caso però devi controllare bene la sequenza del tuo gene "x" in modo che non si creino problemi di frame.

Wunz
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