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GFPina
Moderatore

GFPina
Città: Milano


7930 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2011 : 17:09:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno conosce una ditta alternativa a Invitrogen e Promega che mi possa fornire un vettore per TA cloning? Ho bisogno solo il vettore e non tutto il kit con Ligasi, Buffer ecc... pare sia una cosa molto difficile o ti prendi tutto il kit o niente!

GFPina ^_^

GFPina non Pina!!! (GFP)

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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 16 settembre 2011 : 09:48:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao
Puoi provare questo:

http://www.allelebiotech.com/products/TA-Cloning-Vector.html

Altrimenti, potresti provare a fartelo da te....è abbastanza semplice e ci sono molti protocolli in rete.
Bye
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7930 Messaggi

Inserito il - 16 settembre 2011 : 17:29:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie della risposta RM!

In effetti questa ditta sembra vendere anche solo il vettore, il fatto di comprare solo il vettore era uno scrupolo mio, perchè personalmente mi scoccia spendere soldi per comprare cose che ho già e non mi servono (come la ligasi)
Ma visto che non ho problemi di soldi ma ho molto poco tempo e sia l'opzione di farmelo da sola (che avevo già escluso a priori), sia comprarlo da un nuovo fornitore mi richiederebbero troppo tempo (ah la burocrazia!), dovrò optare per il kit completo!

Al massimo mi rivendo la ligasi! (scherzo!)

Grazie comunque


GFPina ^_^

GFPina non Pina!!! (GFP)

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thejoint84
Nuovo Arrivato



46 Messaggi

Inserito il - 18 settembre 2011 : 14:30:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Qualcuno si è adattato qualche vettore per il TA cloning? Vorrei sapere quanto tempo può prendere e se servono enzimi speciali,
Grazie!!

http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 19 settembre 2011 : 12:21:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao
Ti serve ovviamente un vettore con un sito di restrizione blunt (ecoRV, SmaI etc..) da digerire e al quale aggiungere le T terminali. Se poi amplifichi il prodotto da clonare con una taq proofreading dovrai fare uno step finale con taq non-proofreading per aggiungere la A terminali.
Qualche protocollo:

http://130.15.90.245/t-a_cloning_vectors.htm

http://www.zellbiochemie.uni-bonn.de/pdf/Protokolle/P%2048%20Creating%20dA%20overhangs%20with%20Taq.pdf

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thejoint84
Nuovo Arrivato



46 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2011 : 13:19:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per i protocolli.... ma mi sorge un dubbio... dopo aver tagliato il plasmide in modo da avere blunt end, aggiungo la T con Taq. Penso peró che la Taq a 72 gradi per 2h aggiunga molte piú di una sola T...

Mi conviene forse aggiungere uno stretch di A al mio prodotto di pcr (invece della sola A lasciata dalla reazione con la Taq)???


http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


953 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2011 : 13:35:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la taq polimerasi (non proofreading) aggiunge da sè diverse A al tuo prodotto di PCR, mica una sola.

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RM
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2011 : 17:54:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di RM Invia a RM un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Penso che non sia necessario. Per quanto ne so, a me risulta che la Taq aggiunge una singola A ed una singola T. Il lavoro originario almeno riporta così.

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SpemannOrganizer
Utente

Spemann

Città: Los Angeles


953 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2011 : 18:06:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di SpemannOrganizer Invia a SpemannOrganizer un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da RM

Per quanto ne so, a me risulta che la Taq aggiunge una singola A ed una singola T. Il lavoro originario almeno riporta così.





Si' è vero, ho controllato ora. Aggiunge una singola A

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thejoint84
Nuovo Arrivato



46 Messaggi

Inserito il - 21 settembre 2011 : 22:16:02  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di thejoint84 Invia a thejoint84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora non mi tocca che provarlo..... se mi va bene mi salto un bel passaggio di clonaggio in pGEM-T , selezione cloni, mini-prep, digestione, purificazione dell'inserto e secondo clonaggio.....
Grazieeee, vi farò sapere come va!!!!

http://cornermolecularbiology.blogspot.com/
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