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Asator
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9 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2011 : 17:53:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Asator Invia a Asator un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, ho un problema con l'analisi dei risultati della mia qPCR.

Il progetto che sto svolgendo riguarda lo studio dell'espressione di una famiglia di 30 geni di melo in risposta all'attacco del patogeno fungino Podosphaera leucotricha. La quantificazione tra infettato/non infettato Ú abbastanza semplice: faccio una quantificazione relativa e vedo quali geni vengono sovraespressi (o inibiti).

La difficoltß sorge nel momento in cui voglio studiare l'espressione di questi geni in condizioni normali e osservare il livello "base" di espressione di questi geni (nella pratica devo effettuare 30 amplificazioni su uno stesso campione). Da quel che ho capito, la quantificazione relativa non si puˇ fare in questo caso, quindi serve quella assoluta. Purtroppo, nel mio laboratorio non la usa nessuno, quindi devo un po' arrangiarmi.

In sostanza, devo prendere del cDNA a concentrazione nota, preparare delle diluizioni (diciamo 10 punti in triplo, ognuno diluito 10 volte rispetto al precedente) e amplificare. Il risultato dovrebbe essere un grafico tra i cicli soglia e il logaritmo della concentrazione iniziale di cDNA.
Per preparare il cDNA per la curva ho pensato di amplificare con una normale PCR il cDNA di uno dei miei campioni (usando una coppia di primer di cui conosco le dimensioni del prodotto), quantificare il risultato e quindi usarlo per preparare le mie diluizioni. Ha senso? posso usare la curva risultante per quantificare tutti i miei campioni?

Chiunque se ne intenda mi aiuti a risolvere questa storia!
Grazie!

Martin.diagnostica
Utente Attivo

H. pylori



1582 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2011 : 18:20:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Martin.diagnostica Invia a Martin.diagnostica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mi sembra pi¨ logico clonare il tuo gene in un vettore e poi fare le diluizioni sul vettore purificato (es. miniprep)

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Asator
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2011 : 18:39:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Asator Invia a Asator un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
PerchŔ? che vantaggio ho con il vettore purificato? Inoltre vorrei un sistema il pi¨ veloce possibile (ma ovviamente ci si adegua alle necessitÓ)
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Moloney
Nuovo Arrivato



111 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2011 : 11:31:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Moloney Invia a Moloney un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Asator

Per preparare il cDNA per la curva ho pensato di amplificare con una normale PCR il cDNA di uno dei miei campioni (usando una coppia di primer di cui conosco le dimensioni del prodotto), quantificare il risultato e quindi usarlo per preparare le mie diluizioni. Ha senso? posso usare la curva risultante per quantificare tutti i miei campioni?



Sembra che abbia senso... l'unica Ŕ che purificherei il prodotto di PCR, prima di quantificarlo e diluirlo.
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Martin.diagnostica
Utente Attivo

H. pylori



1582 Messaggi

Inserito il - 15 ottobre 2011 : 14:00:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Martin.diagnostica Invia a Martin.diagnostica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io ho sempre quantificato da plasmide . Del resto esistono vettori di clonaggio talmente efficienti che per costruire lo standard ci vogliono 3 o 4 giorni.

La PCR di cDNA mi sembra una costosa via e propensa alla contaminazione. Il prodotto clonato lo puoi sequenziare e anche riutilizzare in futuri (ti prepari uno stab)

eccoti i consigli della appliesdbiosystems ;D
http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/real-time-pcr/absolute-vs-relative-quantitation.html


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