Estrazione plasmidica

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Microlab
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2 Messaggi

Inserito il - 19 ottobre 2011 : 12:54:32

Ciao a tutti!
Volevo porvi un quesito...sono ormai mesi che faccio una ligasi tra un frammento portatore di una resistenza ad un antibiotico ed un plasmide. Le cellule crescono su piastre contenenti agar + antibiotico, la pcr delle colonie scelte viene fatta utilizzando degli oligo che amplificano il frammento inserito e risulta positivo, ma l'estrazione plasmidica non estrae nulla.
secondo voi perch�????
Grazie
Microlab

RM
Nuovo Arrivato

115 Messaggi

Inserito il - 19 ottobre 2011 : 16:55:51

Ciao
I primers sono interni, cio� legano entrambi sull'inserto, oppure ne hai uno sull'inserto e l'altro sul vettore? te lo chiedo perch� nel primo caso � abbastanza frequente avere falsi positivi.

Microlab
Nuovo Arrivato

2 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2011 : 21:45:19

Ciao, si i primer sono interni legano entrambi sull'inserto, in ogni caso non si spiegherebbe perch� crescono su terreno con antibiotico.
Grazie
Microlab

Martin.diagnostica
Utente Attivo

1582 Messaggi

Inserito il - 20 ottobre 2011 : 22:11:08

Citazione:
ma l'estrazione plasmidica non estrae nulla.
secondo voi perch�????

Scusa non capisco bene cosa intendi per negativa? le cellule non contengono il tuo vettore o semplicemente le cellule contengono il vettore ma la PCR x vedere se dentro c'� l'inserto da esito negativo?

Se fosse il primo caso io proverei a estrarre il vettore senza inserto da una coltura fatta dalla stab (ha
iuno stab?)

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SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 21 ottobre 2011 : 12:57:57

da come ho capito io sembrerebbe con nn riesce a estrarre proprio il plasmide