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Valium 777
Nuovo Arrivato

Biohazard
Prov.: Napoli
Città: Acerra


9 Messaggi

Inserito il - 02 novembre 2011 : 19:27:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Valium 777 Invia a Valium 777 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao ragazzi, voglio descrivermi la mia esperienza e spero che qualcuno di voi possa darmi una mano!!
Sto lavorando con delle neurosfere che ho fatto io isolando mesencefalo e corteccia di topo C57BL/6 wild type ad E13-14. Ho piastrato le cellule ad una densità di 10^5/mL in flask T25 con mezzo appropriato (DMEM/F12 con N2, bFGF ed EGF). Il mio problema inizia nel momento in cui provo a dissociarle per piastrarle in adesione e fare il differenziamento nei 3 linage principali. Quello che faccio è raccogliere le sfere con una pipetta, trasferirle in falcon da 15, lasciarle sedimentare (a volte ho anche centrifugato) e spipettarle con una pipetta da 5mL con la punta gialla per dissociarle meccanicamente. Quello che mi trovo è:
1. Alla conta la maggior parte sembrano morte (sono positive al Trypan) o almeno cosi sembra perchè trovo delle dimensioni molto eterogenee sul vetrino (alcune sono piccolissime e sembrano detriti ma non si capisce bene)
2. Dalla conta mi trovo un numero di cellule molto inferiore a quello che mi aspetto (sui 5 milioni e 8) mentre se provo a spipettarle piu blandamente trovo che al piastramento la maggior parte sono ancora aggregate.
3. Quando provo a pellettarle per centrifugazione sembra che ne perda un bel po nel surnatante.
4. Quelle poche riesco a piastrare (su multiwell con coat di polilisina in Neurobasal medium + B27+ l-glutammina+bFGF) il giorno dopo sono quasi tutte a galla e quelle adese sono così poche che non vale la pena continuare con il differenziamento.

Ho provato anche a usare la papaina che risolve il problema della conta (le cellule stanno meglio e non sono morte ma il numero è ancora basso) però le cellule il giorno dopo non stanno bene (sono tondeggianti e bianche sebbene adese).
Ho letto il vostro protocollo ma non riesco a capire cosa sono le soluzioni di cui parlate, fa forse parte di un kit?

Vi prego aiutatemi non so come venirne a capo!!

Citosina
Nuovo Arrivato

citosina

Città: Milano


73 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2011 : 12:59:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Citosina Invia a Citosina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,

Non ho lavorato nello specifico non neuorosfere, però provo a darti una mano. Sul fatto che le cellule siano morte quando vai alla conta..non so, potrebbe dipendere da come spipetti. Se sono cellule molto delicate, è oppurtuno spipettare non troppo energicamente. Magari spipetti un minuto in più ma con più delicatezza in modo tale da stressare meno le cellule. Inoltre cosa usi per dissociare? Dissoci solo meccanicamente o usi anche un qualche enzima? In genere viene utilizzata la tripsina, ma l'invitrogen vende il Tryple che dissocia molto bene senza essere aggressivo sulle cellule. Oppure sei sicuro di lasciare sedimentare per abbastanza tempo le neurosfere? Io con le mie cellule, se le colonie erano piccole, lasciavo sendimentare anche quasi 3 quarti d'ora...altrimenti le perdevo quasi tutte. A quanto centrifughi?

Infine, potrebbe anche essere che le cellule non stiano bene già prima di iniziare il differenziamento. Io quando utilizzavo le staminali avevo questo problema a volte: nelle colture indifferenziate sembravano belle, poi quando cominciavo a differenziare facevano proprio schifo e spesso morivano..e in genere accadeva quando le cellule erano già a passaggi un po' elevati. In quel caso, semplicemente cambiavo le cellule di partenza.

Per quanto riguarda il protocollo...boh, ho provato anche io a guardare e credo che si riferisca a un kit. Magari prova a vedere sui siti dell'invitrogen o della sigma se per caso vendono qualcosa di specifico!
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Valium 777
Nuovo Arrivato

Biohazard

Prov.: Napoli
Città: Acerra


9 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2011 : 21:23:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Valium 777 Invia a Valium 777 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In genere dissocio solo meccanicamente, ho provato solo una volta a usare papaina+ DNAsi ma con scarsi risultati. Per quanto riguarda le pipettate sono abbastanza certo di essere il più delicato possibile (e per togliermi tutti i dubbi ho fatto lavorare una collega con più esperienza in palallelo con me, stessi risultati), non sono assolutamente frettoloso quando lavoro in camera cellule, anzi perdo la cognizione del tempo. Stamattina mi hanno consigliato di dissociarle un po prima di quando lo faccio io (cioè al 5° giorno) perchè potrebbe essere che mi porto dietro le cellule necrotiche che stanno al centro delle sfere, possibile? Proverò in quest'altro modo e vi farò sapere.
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Citosina
Nuovo Arrivato

citosina

Città: Milano


73 Messaggi

Inserito il - 03 novembre 2011 : 22:04:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Citosina Invia a Citosina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se anche chi ha più esperienza di te ottiene i tuoi stessi risultati allora non è sicuramente un problema di spipettamento. Comunque il discorso delle cellule necrotiche al centro potrebbe essere vero, almeno in parte. Ricordo di aver letto, anche se non ricordo più dove, che in generale le cellule coltivate in vitro al centro di qualche struttura - come appunto colonie di staminali, che sono anch'esse sferiche, cardio/neurosfere - possono un po' "soffrire" perchè i nutrienti fanno più fatica ad arrivare. Ora non so quanto possa essere realmente vero, però tentar non nuoce... Io quando lavoravo con le staminali mi hanno sempre detto che le colonie dovevano avere le giuste dimensioni per differenziarle (un po' perchè altrimenti differenziavano già, un po' perchè si ottenevano risultati migliori da colonie più piccole..anche se nessuno mi ha mai saputo dire esattamente il motivo).

comunque fammi sapere che questa cosa mi incuriosice!
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