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handel
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23
Città: Milano


6 Messaggi

Inserito il - 22 novembre 2006 : 16:48:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di handel Invia a handel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti,
spero che qualcuno mi possa essere d'aiuto!
Ho da poco cominciato a fare la Mutagenesi per PCR e vorrei sapere una cosa: ho disegnato due oligo complementari di circa 40pb con la mutazione al centro, ho speranze di riuscita? Tra l'altro ho provato un paio di volte ma sembra non esserci alcun amplificato..che siano sbagliati gli oligo? Esiste un altro modo per disegnarli?

Graazie!

HANdel

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 23 novembre 2006 : 00:36:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In teoria sembra giusto... ma dacci qualche info in più, tipo quanto è lungo il pezzo da amplificare, che mutazione fai etc etc...

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handel
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23

Città: Milano


6 Messaggi

Inserito il - 23 novembre 2006 : 16:19:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di handel Invia a handel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
E' una mutazione non conservativa ad un singolo aa di una proteina di circa 6500bp..
Grazie!

HANdel
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lauretta
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 24 novembre 2006 : 15:54:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lauretta Invia a lauretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!i primer così come dici di avrli disegnati vanno bene per una reazione di mutagenesi!6500 è la dimensione del gene?immagino sia clonato in unvettore di almeno 4000bp quindi l'amplificato è molto lungo occorre una tac specifica per lunghi frammenti!in bocca al lupo!!
lauretta
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handel
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23

Città: Milano


6 Messaggi

Inserito il - 24 novembre 2006 : 16:52:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di handel Invia a handel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si lauretta, il gene è di 6500bp ed è inserito in pCDNA3!
Grazie

HANdel
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handel
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23

Città: Milano


6 Messaggi

Inserito il - 27 novembre 2006 : 13:55:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di handel Invia a handel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate ma ho un dubbio..
Se i primer che uso sono complementari, che probabilità c'è che si leghino al templato e non tra loro e formino dimeri?
Il mio problema principale è che dalla corsa su gel di agarosio a basso pm vedo i primers e non ho alcun amplificato!

Grazie!!

HANdel
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 27 novembre 2006 : 20:33:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hmmm no, questa è in genere una cosa da evitare, i primer non dovrebbero avere regioni complementari fra di loro. Forse è questo il problema

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handel
Nuovo Arrivato

0613_da_Fil23

Città: Milano


6 Messaggi

Inserito il - 28 novembre 2006 : 13:16:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di handel Invia a handel un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cominciavo effettivamente a pensare che il problema fosse proprio quello..
Grazie Chick80

HANdel
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AleXo
Moderatore

OrniAle

Prov.: Estero
Città: San Francisco, California


1550 Messaggi

Inserito il - 28 novembre 2006 : 13:31:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di AleXo  Invia a AleXo un messaggio AOL Invia a AleXo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per molti tipi di PCR mutagenesi i primer sono parzialmente o totalmente complementari (ed ovviamente le reazioni sono + "tricky")...
se riesci, cerca di descrivere + in dettaglio cosa stai cercando di fare!

Da come mi sembra di aver capito dev'esser qualcosa simile a questa procedura descritta in allegato:
Allegato: PCR mutagenesis.pdf
76,15 KB

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lauretta
Nuovo Arrivato



9 Messaggi

Inserito il - 29 novembre 2006 : 11:38:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lauretta Invia a lauretta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao i primer per mutagenizzare tramite pcr devono essere complementari tra loro quindi in parte formeranno dei dimeri ed in parte si legheranno al templato!prova a seguire queste condizioni ed utilizzare la taq phusion(high-fidelity DNA polimerase) della FINNZYMES
10ng templato
125ng primers

ciao
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kate84
Nuovo Arrivato



17 Messaggi

Inserito il - 13 ottobre 2012 : 18:29:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kate84 Invia a kate84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti! anche io dovrei fare una mutaagenesi e volevo chiedervi in che modo purificate i primer....grazie!
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