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nellaanto9
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4 Messaggi |
 Inserito il - 23 novembre 2011 : 14:44:31
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Salve a tutti, sto cercando di purificare una proteina cha ha una coda di 6 istidine all'N-terminale..ieri l'ho passata sulla colonnina nichel e non mi si è attaccata!dato confermato dal fatto che facendo il gel l'ho ritrovata nel FT e non nell'eluato...dato che sono alle prime armi..e non ho molta esperienza..qualche consiglio?se la proteina fosse in condizioni denaturate potrebbe legarsi?praticamente come posso fare?grazie mille!
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nellaanto9
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2011 : 14:50:33
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| è una proteina umana espressa in E.Coli |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2011 : 16:52:34
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è dicci di più, i buffer e i pH? la chimica dell'imidazolo cambia notevolmente in base al pH hai incubato ON la resina e l'estratto. hai fatto un blot con siero anti hist-tag?
Cmq la risposta alla tua domanda è si può cambiare se si lavora in condizioni denaturanti |
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nellaanto9
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4 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2011 : 17:50:49
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ho eluito con un baffer pH 7,5 contenete 500mM imidazolo per quanto riguarda la resina ho usato una colonnina commerciale giò pronta..(me l'ha data il prof!)
grazie delle risposta! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 23 novembre 2011 : 18:06:57
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Come ti ha detto Martin se vuoi un aiuto devi darci TUTTE le informazioni possibili!
1) in che buffer è la tua proteina prima della purificazione?
Se è in condizioni denaturanti si può benissimo purificare, ma devi utilizzare un protocollo adeguato e una colonna adeguata.
2) che colonna hai utilizzato? (dicci pure la ditta)
3) che buffer hai utilizzato (tutti, non solo quello di eluizione, anche perché se la tua proteina è nel FT, l'hai persa subito e l'eluizione non ci interessa a questo punto)
Tieni presente che per purificare una proteina His-tag con colonnine Ni-NTA puoi fare 3 cose:
1) purificazione in condizioni native: se la tua proteina è in buffer nativo (non denaturante). Utilizzi buffer nativi e eluisci con imidazolo
2) purificazione in condizioni denaturanti: se la tua proteina è in buffer denaturante e la vuoi purificare mantenendola in condizioni denaturanti. Utilizzi buffer denaturanti e eluisci con diverso pH (non usi imidazolo)
2) purificazione in condizioni ibride: se la tua proteina è in buffer denaturante e la vuoi purificare portandola in condizioni native. Utilizzi buffer denaturanti fino ad un certo punto, poi passi a buffer nativi e eluisci con imidazolo.
Quindi dovresti veramente farci capire cosa dovresti fare e cosa hai fatto, se no è molto difficile aiutarti.
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nellaanto9
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4 Messaggi |
Inserito il - 24 novembre 2011 : 10:01:38
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1) tampone pH 7,8 : 20mM Hepes, 500mM NaC, 5mM Imidazolo
2) HisTrap™ HP Columns - Easy, High-performance Purification GE Healthcare
3) buffer di eluizione pH 7,5 20 mM Hepes, 500mM NaCl, 500mM imidazolo
il FT l'ho raccolto e dal gel si vede che la proteina è tutta lì..
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