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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
 Inserito il - 06 dicembre 2011 : 11:25:23
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Ciao a tutti! Dovrei trasformare delle cellule competenti con un plasmide che ho qui in lab, il problema è che ho solo 100 uL di soluzione contenente il plasmide ad una concentrazione bassissima, vorrei poter diminuire il volume della soluzione per poi procedere alla trasformazione. Come posso fare? c'è chi sugeriva qui in lab di lasciare la provetta con il DNA aperta nel termomixer a temperatura elevata e lasciare che il solvente (TE) evapori un po'...voi che proponete? grazie in anticipo!
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 13:37:51
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Ti suggerisco di concentrare il DNA nel seguente modo:
- Add H2O up to 100 uL
- Add 2 vol EtOH 100% freddo (-20 °C)
- Add 1 #956;L glicogeno (soluzione 20 mg/mL) / 100 #956;L soluzione iniziale
- Incubare a -20 °C 20’
- 12000 x g 15’
- Buttare il sup
- Lavare in 2 vol EtOH 70%
- 12000 x g 10’
- Buttare il sup
- Asciugare il pellet all’aria
- Risospendere in H2O sterile
E comunque ricorda che per una trasformazione bastano pochi ng di DNA |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 13:39:13
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| scusa, invece di "microlitri" appare "#956;L" |
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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 13:45:43
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| E' possibile che io abbia talmente poco DNA da non vedere il pellettino? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2011 : 14:27:50
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| il pellet è davvero difficile da vedere, a volte. se il DNA è poco, vedrai solo una striscetta minuscola e traslucida, ma la vedrai! prova ad orientare l'eppendorf nella centrifuga in modo da sapere dove va a finire il tuo pellet, e stai attenta quando prelevi il sup... non ti trascinare via il DNA! |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 02:40:25
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Personalmente ti direi di fregartene, io trasformo con 1 ng di plasmide e non ho mai avuto grossi problemi.
Il tuo plasmide quanto è concentrato? |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 13:44:57
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Non lo so!perchè lo spettrofotometro non mi rilevava niente quando ho quantizzato 1 uL della soluzione che ho...oggi provo a quantizzare 5 uL e vedo se lo spettrofotometro vede qualcosa.... uff  |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 13:51:51
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Ti suggerisco anche di correrne un paio di uL su gel d'agarosio, almeno così vedi che faccia ha! E poi a seconda del plasmide che hai e delle cellule che usi, potrebbero essere necessari addirittura pochi pg!!!
A me di pUC in DH5alfa ne son serviti meno di 200pg!!! |
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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 13:53:06
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| Ho corso 20 uL e non si vedeva niente.... |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 14:16:50
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Mi dispiace dirtelo, ma credo tu debba ripartire dal glicerinato e poi estrarlo di nuovo!
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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 14:28:46
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| Sigh! il problema è che questo è un plasmide che mi hanno spedito su carta...non ne ho altro, devo cercare di recuperarne almeno un pochino, sennò sono fritta! |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 15:04:05
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prova a trasformare comunque. a meno che non ci fosse nulla su carta, o tu non abbia sbagliato qualcosa, con poche molecole di DNA riuscirai ad ottenere delle colonie per fare uno stock in glicerolo.
buona fortuna! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 15:24:18
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Quanto è grosso il plasmide? Hai dei primers per farci sopra una PCR, così ne usi poco e ti accerti che nella tua soluzione ci sia.
Puoi provare a trasformare comunque, ma se non funzionasse e non hai altre possibilità di riprocurarti il plasmide l'ultima spiaggia sarebbe quella di amplificarlo mediante PCR, ti servono solo una polimerasi proof-reading, due primers in qualsiasi punto del plasmide che si attacchino coda-coda (per amplificare tutto il plasmide) e una ligasi! |
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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 16:40:49
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Il plasmide è più di 6000bp...poichè ho tentato una trasformazione con soli 20 ul ( e ci sono delle colonie, ma poche in più rispetto controllo...) sto pensando di fare comunque dei mini inoculi e miniprep + digestione per controllare se da una di quelle colonie ottengo il mio plasmide....speriamo bene!
In extremis posso ordinare i primers, o fare come mi suggeriva roberta s. e provare a precipitare quel poco di DNA che c'è...oppure ancora ho conservato il pezzetto di carta da cui ho estratto il plasmide e provare a Riestrarre se c'è qualcosa....mah! |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 16:49:24
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| ok, perfetto. se hai delle colonie, inoculale, fatti uno stock e estrai il plasmide! |
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immetella
Nuovo Arrivato
Prov.: Pescara
Città: Pescara
32 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 16:53:07
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Esatto! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2011 : 19:20:54
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Beh allora incrociamo le dita, speriamo che in quelle colonie ci sia il plasmide giusto!
In ogni caso, precipitare il plasmide per concentrarlo va bene se ne hai abbastanza e vuoi solo concentrarlo, ma sta attenta che un po' comunque si perde, quindi se ne hai poco non lo utilizzare tutto per riprecipitarlo.
Beh speriamo, che il tuo problema si sia giá risolto, ma i ogni caso stai tranquilla perché se anche se fossi messa male di strade per recupererebbe il plasmide ce ne sono!
Facci sapere.
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Concentrare DNA plasmidico per trasformazione
Didattica
