Estrazione del DNA con il metodo del CTAB

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Stella88
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3 Messaggi

Inserito il - 15 dicembre 2011 : 22:56:23

Buonasera a tutti,sono nuova e ne approfitto per salutarvi..
Ho da chiedervi dei chiarimenti sul perch� di alcuni passaggi durante un protocollo di estrazione; intanto ve lo riassumo:
Estrazione del DNA con il metodo del CTAB da campioni vegetali:
- Triturazione con N2 liquido e CTAB
- Aggiunta di CTAB caldo e di proteasi K;bagnetto termostato 60 gradi per 60'
- Aggiunta RNasi + bagnetto 37 gradi per 30'
- Aggiunta di cloroformio/alcool isoamilico (24:1)e centrifugazione
- Recupero il sopranatante e precipitazione del dna tramite aggiunta di alcol isopropilico e centrifugazione
- Eliminare l'isopropanolo e sostituirlo con etanolo assoluto e centrifugazione.
- Risospensione del pellet in H2O dopo aver allontanato l'etanolo.

Vorrei chiedervi: Perch� si usa cloroformio e alcol isoamilico e non si usa il Fenolo? da cosa dipende se preferire l'una o l'altra soluzione?
Poi, perch� si precipita con isopropanolo e non direttamente con etanolo?
Perch� poi si usa etanolo assoluto? e non etanolo al 70% come in molti protocolli?
Un altra cosa: L'Rnasi aggiunta nello step 3 non viene degradata dalla proteasi aggiunta prima?
Scusatemi per la lunghezza del post e grazie in anticipo..