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Celeste
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2006 : 12:31:47
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Ciao a tutti, questa è la prima volta che scrivo sul forum...e non per aiutare qualcuno ma per farmi aiutare!
Il mio lavoro consiste nel valutare la funzionalità di un promotore in presenza di singoli polimorfismi, e per fare questo è stato inserito in un vettore a monte del gene della luciferasi. I polimorfismi noti sono stati inseriti mutagenizzando il vettore contenente la sequenza wt. Con questi plasmidi mutagenizzati ho trasfettato in modo transiente cellule Hela. Tutti i polimorfismi diminuivano l'attività del promotore rispetto al wt, anche quelli che non si trovavano su un putativo sito di legame per fattori di trascrizione. E' sorto il dubbio che in qualche modo la tecnica fosse sbagliata ed il modo per verificarla era rimutagenizzare a wt un vettore con un polimorfismo (wt-r). Fatto, dal sequenziamento risulta corretto. L'ho inserito in Hela nello stesso esperimento in cui ho utilizzato anche wt e plasmide mutagenizzato di "origine"(mut). Risultato atteso: wt e wt-r --> stesso risultato; mut --> < funzionalità.
 Risultato ottenuto: wt --> max funzionalità; wt-r --> funziomnalità <<<; mut --> < funzionalità. Una tragedia !
Sperando di aver scambiato i plasmidi ho rifatto l'eperimento 3 volte ma il risultato è stato purtroppo comfermato. Qual'è il problema? Cosa faccio che non va?
Qualcuno mi aiuti!
Grazie 
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Celeste |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
 Inserito il - 01 dicembre 2006 : 13:36:42
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Innanzitutto cerca lavorare su linee cellulari Cos7 (le cellule esprimono meglio e più velocemente).
Prova anche cambiare tecniche di trasfezione Lipofectamina/ FewGene se pensi che sia un problema legato alle trasfezioni
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Risultato atteso: wt e wt-r --> stesso risultato; mut --> < funzionalità.
Risultato ottenuto: wt --> max funzionalità; wt-r --> funziomnalità <<<; mut --> < funzionalità. Una tragedia
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Non sei tanto lontano dalla "vittoria"; mut--> confermato sperimentalmente. Wt è funzionale, l'unico problema resta wt-r, che ha espressione quasi nulla.
Potrebbe essere che quel tipo di mutazione influenzino il promotore perciò la funzionalità non è ottimale.
Hai controllato che la mutazione non porti ad uno stop codon??
Ti consiglio di lavorare con il sistema Gateway.
http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=4072&cid=fl-GATEWAY
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www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2006 : 13:38:46
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Dimenticavo....
...benvenuto sul forum! |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Celeste
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2006 : 16:39:05
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Non c'è nessuna mutazione in wt-r rispetto a wt, sono identici. E' legato a questo il mio problema. Se il sistema funzionasse bene dovrei avere la stessa risposta di trasfezione, entro i limiti della deviazione standard, dato che hanno la stessa sequenza. Inoltre wt mi da valori di trasfezione molto alti, paragonabili a reale promotore della luciferasi, quindi la trasfezione va bene. Non so che fare.
Grazie comunque per i consigli.
PS:Un DNA troppo diluito può dare problemi? C'è il rischio che l'agente trasfettante sia troppo diluito anche se il DNA è nelle giuste quantità?
Dimenticavo, in questo periodo i problemi abbondano, qualcono ha trasfettato ancora le cellule THP-1 con FuGene6 della roche?
Ancora mille grazie
Ciao
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Celeste |
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