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liciageno
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107 Messaggi

Inserito il - 03 gennaio 2012 : 11:57:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di liciageno Invia a liciageno un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao,
Qualcuno Ŕ a conoscenza del CloneEZ PCR Cloning kit?
Devo usarlo per clonare un prodotto di PCR.
Per evitare di avere problemi con il clonaggio classico che include enzimi di restrizione, mi hanno consigliato questo kit.
Vi spiego:
Ho un plasmide che contiene una sequenza che voglio clonare in un altro vettore.
Da quello che ho capito, devo isolare questa sequenza tramite PCR dopo aver linearizzato il vettore (?) e poi inserirlo nel vettore di destinazione che giń ho.
Come devo fare, lo posso usare questo kit?
Grazie mille

mollichina di pane
Utente Junior

Miyu



121 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2012 : 09:26:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di mollichina di pane Invia a mollichina di pane un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao liciageno!
Non ho mi usato il kit di cui parli. Per˛, per quella che Ŕ la mia esperienza, posso dirti che passare una sequenza da un plasmide ad un altro, non richiede grossi problemi. Se fossi in te, prima di comprare un kit (in genere hanno prezzi pi¨ alti dei singoli reagenti) proverei la strada tradizionale.
Non Ŕ necessario linearizzare il plasmide iniziale!
Ci fai su la PCR con gli oligo con i siti di restrizione giusti (studiali bene!!!!), digerisci l'inserto e il plasmide in cui vuoi clonarlo e poi fai la ligation.
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GFPina
Moderatore

GFPina

CittÓ: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2012 : 12:09:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da liciageno

Da quello che ho capito, devo isolare questa sequenza tramite PCR dopo aver linearizzato il vettore (?) e poi inserirlo nel vettore di destinazione che giń ho.


No, il vettore che devi linearizzare e quello di destinazione, la tua sequenza invece l'amplifichi mediante PCR senza linearizzare, sarebbe assolutamente inutile.
In due parole il sistema funziona cosý:
- linearizzi il vettore di destinazione utilizzando due enzimi di restrizione
- amplifichi il tuo frammento inserendo alle estremitÓ le stesse sequenze di restrizione con cui hai linearizzato il vettore
A questo punto al posto di fare un clonaggio classico tagliando il frammento e ligangolo nel vettore, non fai altro che mettere il vettore linearizzato e il frammento (non tagliato) assieme in presenza di un enzima (che altro non Ú che una ricombinasi), avviene la ricombinazione e il frammento si lega al vettore.
Comunque se leggi il data sheet ti spiega tutto: http://www.genscript.com/tech_guide/TM0279.pdf

Il clonaggio per ricombinazione Ú sicuramente pi¨ efficiente del clonaggio con ER e ligasi e ti evita vari passaggi.
Io clono praticamente sempre per ricombinazione, anche se ho utilizzato vari altri metodi e mai questo.

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liciageno
Nuovo Arrivato



107 Messaggi

Inserito il - 04 gennaio 2012 : 16:16:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di liciageno Invia a liciageno un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per la mia sequenza PCR, devo avere dei primer per÷ che contengano i siti per gli enzimi di restrizione con cui poi taglier÷ il vettore di destinazione, vero?
PerchŔ mi dici frammento non tagliato?
Io faccio la PCR della mia sequenza, la isolo su gel, la purifico e poi la uso per genscript insieme al vettore che avr÷ digerito (con gli stessi enzimi di restrizione).
Inoltre, la CloneEZ sarebbe una ricombinasi?
Grazie mille
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GFPina
Moderatore

GFPina

CittÓ: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 05 gennaio 2012 : 00:27:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ti consiglio di leggere io data sheet, che ti ho anche linkato, dove troverai tutte le informazioni!

Comunque rispondo alle tue domande.
Citazione:
Per la mia sequenza PCR, devo avere dei primer per÷ che contengano i siti per gli enzimi di restrizione con cui poi taglier÷ il vettore di destinazione, vero?
PerchŔ mi dici frammento non tagliato?

A queste due rispondo assieme perchŔ la risposta Ŕ la stessa.
In un clonaggio classico tu tagli sia il vettore che il frammento con gli stessi enzimi di restrizione in modo da avere estremitÓ che si possano legare tra loro, poi metti la ligasi e li unisci.
Questo invece Ŕ un clonaggio per ricombinazione omologa, devi avere delle sequenze "uguali" sia nel vettore che nel frammento in modo che a quel livello possa avvenire ricombinazione e il frammento venga "inserito" nel vettore. Per questo motivo al tuo frammento devi aggiungere delle sequenze che siano "le stesse" presenti all'estremitÓ del vettore (in realtÓ leggendo il data sheet vedrai che devi mettere almeno 15nt), ora se tu tagliassi il frammento taglieresti via il pezzo di sequenza "uguale" a quella del vettore (spero sia chiaro senza dovertelo disegnare) e il risultato sarebbe che non potresti fare alcuna ricombinazione! Potresti semplicemente fare un clonaggio classico con la ligasi.

Citazione:
Inoltre, la CloneEZ sarebbe una ricombinasi?

Sý, il "CloneEZ Enzyme" Ŕ una ricombinasi!
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liciageno
Nuovo Arrivato



107 Messaggi

Inserito il - 05 gennaio 2012 : 12:33:01  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di liciageno Invia a liciageno un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Va bene grazie mille per la spiegazione. Se ho dei dubbi ancora non esitero' a contattarti ;)
ciaoo
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