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 amplificazione cDNA tramite RT PCR
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pasqualep.
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Prov.: NA
Città: C/MARE DI STABIA


12 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2012 : 11:26:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di pasqualep. Invia a pasqualep. un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti
vorrei chiedere dei chiarimenti riguardo la RT PCR (non la real time, ma la retrotrascription pcr). Gli enzimi che utilizzo per una RT PCR sono una retrotrascrittasi e una DNA polimerasi... tuttavia non mi è chiaro in un normale esperimento, (non ho mai fatto RT PCR ma solo PCR) se la retrotrascrizione avviene in vitro oppure la si fa avvenire nel termociclatore... e in ogni caso chi mi sintetizza il 2° filamento a DNA in questo caso?
Quello che io penso, ma voi correggetemi, è che prima mi creo il cDNA con la RT e i metodi per il 2° filamento e poi con primer specifici me lo amplifico. Tuttavia ho letto che in certi casi si fa avvenire direttamente tutto in vitro facendo una fase di retrotrascrizione ed una di amplificazione in cicli successivi. In tal caso ancora il dubbio che mi viene è come si crea il secondo filamento? L'rna non influenza negativamente se è ancora ibridato al DNA? E infine, è vero che esistono anche enzimi con doppia attività sia retrotrascrivente che di dna polimerasi??

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 19 gennaio 2012 : 18:33:03  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sono un po' di fretta, comunque se cerchi sul forum se ne è parlato diverse volte!

In due parole:
- la fase di retrotrascrizione con la retrotrascrittasi ti permette di sintetizzare il filamento complementare all'RNA, quindi ottieni un cDNA ibrido DNA/RNA
- a questo punto le opzioni sono due:
1) degradare il filamento di RNA (molte retrotrascrittasi anche anche l'attività RNAsica) e ti rimane in cDNA a singolo filamento
2) utilizzare il cDNA così com'è nella PCR
- nel primo ciclo di amplificazione con la DNA polimerasi si forma il secondo filamento di cDNA (quello corrispondente all'RNA)
poi negli altri cicli hai l'amplificazione.
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