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 Biologia Molecolare
 RNAZOL e TRIZOL (estrazione RNA)
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Autore Discussione  

biomolecola
Nuovo Arrivato


Prov.: Napoli
Città: Napoli


40 Messaggi

Inserito il - 06 dicembre 2006 : 14:01:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biomolecola  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di biomolecola Invia a biomolecola un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti...ho un nuovo problema che sicuramente mi aiuterete a risolvere. Sono abituata a fare estrazione di RNA da cellule in TRIZOL.
Ora mi sono arrivati dei campioni che sono stati conservati per molti mesi a -80°C in RNAZOL.
Le domande sono 2:
1) quant'è alta la probabilità che dopo tanti mesi di conservazione riesca comunque ad ottenere un buon estratto?
2) posso utilizzare lo stesso protocollo che uso per le cellule in TRIZOL anche se in questo caso si tratta di RNAZOL?
Grazie a tutti anticipatamente!

W la ricerca

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 06 dicembre 2006 : 15:12:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non credo che ci siamo grosse differenze, dovrebbero essere più o meno la stessa cosa!
Comunque prova a guardare questo forum dove hanno discusso della stessa cosa:
http://molecularbiology.forums.biotechniques.com/forums/viewtopic.php?p=49452

e qua trovi un protocollo per l'estrazione da cellule in RNAzol:
http://microarrays.nki.nl/download/protocols/RNA%20Isolation.pdf

Per quanto riguarda la prima domanda l'RNAzol dovrebbe anche conservare l'RNA e quindi se sono stati conservati correttamante a -80°C non dovrebbe crearti problemi!
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 07 dicembre 2006 : 08:07:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo con GFPina, non dovresti aver problemi se sono stati tenuti a - 80°C adeguatamente.Che tipo di campioni sono?
Alla fin fine non cambia tanto tra i due metodi estrattivi, ma visto che ora hai quello per l'RNAzol usalo, no?
Facci sapere come è andata!
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staminale
Nuovo Arrivato


Città: Roma


28 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2006 : 12:01:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di staminale Invia a staminale un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
SCUSATE SE MI INTROMETTO IN QUESTA DISCUSSIONE...MA MI E' SORTA UNA CURIOSITA'!!
Qual'è il modo giusto per congelare i campioni sui quali verrà poi fatta l'estrazione dell'RNA??
e' da poco che io faccio RT-PCR e comunque mi hanno detto di lavare il campione con PBS per 2 volte e poi asciugare bene il pellet ...quindi congelare a -80°C!
vorrei sapere quanto è giusto congelare i pellet in questo modo..e per quanto tempo!
Grazie ..ciao a tutti

alessandra
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Crick82
Utente Junior



139 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2006 : 13:44:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Crick82 Invia a Crick82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Staminale, io per eseguire l'estrazione dell'RNA uso questo metodo:
lavo 2 volte con PBS, tolgo tutto il PBS residuo e poi aggiungo TRIZOL, con lo screper poi stacco le cellule e verso cellule con TRIZOL in eppendorf che conservo a -80°C. Quando dovrò effettuare l'estrazione continuerò il protocollo.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2006 : 18:10:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io non estraggo con TRIZOL e quindi congelo semplicemente il pellet così com'è (a secco!), si possono comunque aggiungere sostanze che conservano l'RNA come lo stesso TRIZOL o RNAlater, io preferisco evitare perchè si fa fatica ad eliminare l'RNA later e non ho mai avuto problemi!
Ho estratto anche da campioni che erano lì da anni e l'RNA c'era!

Ciao
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Silvy
Nuovo Arrivato

Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario


26 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2007 : 18:17:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Silvy Invia a Silvy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao
mi riallaccio a questa discussione di parecchi mesi fa perchè volevo avere un ulteriore chiarimento. Infatti oggi per la prima volta ho estratto RNA con Trizol (prima lo estraevo con il kit Qiagen) e mi chiedevo questo:
per le cellule adese, il protocollo dice di lisare direttamente le cellule sulla piastra. Ho visto però, girovagando su Internet, che ci sono molte variazioni sul tema. Io ho staccato le cellule con tripsina, vi ho aggiunto del terreno, quindi ho centrifugato e ho risospeso il pellet con Trizol. Mi chiedevo se, prima di aggiungere la tripsina, è opportuno fare un lavaggio in PBS e se è meglio lavare anche il pellet ottenuto con del PBS (io seguivo questa procedura prima di procedere alla purificazione su colonnine Qiagen).Il dubbio mi è sorto perchè, sempre nel protocollo Trizol, in riferimento alle cellule in sospensione è scritto di evitare di lavare le cellule prima dell'aggiunta del Trizol, poichè potrebbe verificarsi la degradazione dell'RNA.
Se avete qualche suggerimento da darmi in base alla vostra esperienza, sarà ben accetto.
Grazie...
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Silvy
Nuovo Arrivato

Prov.: Bergamo
Città: Trescore Balneario


26 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2007 : 18:51:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Silvy Invia a Silvy un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Già che ci sono, chiedo anche questo: lo step di incubazione a 55-60°C dopo aver risospeso il pellet di RNA, va fatto anche quando si risospende con acqua oppure solo se si risospende con la soluzione 0,5% SDS? Dal protocollo non mi sembrava molto chiaro, e inoltre ho visto che nel protocollo inserito in questo sito, lo step in questione non è indicato.
Ciao...
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alexct82
Nuovo Arrivato

remi

Prov.: ct
Città: catania


26 Messaggi

Inserito il - 29 ottobre 2007 : 19:43:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di alexct82 Invia a alexct82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Concordo con GFPina!anche io utilizzo il TRIZOL come metodo d estrazione. conservo i pellet ( A SECCO) a -80 e poi appena mi serve estraggo l'RNA (sia da tessuti, che da cellule che da pellet di globuli bianchi isolati da sangue...Abbiamo estratto RNA da pellet conservati a -80°C per diversi anni e le rese sono state ottime!
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cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
Città: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 09 novembre 2007 : 17:32:47  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
prima lo estraevo con il kit Qiagen

perche' mai lo hai abbandonato?
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cami
Utente Junior

p

Città: roma


136 Messaggi

Inserito il - 16 aprile 2010 : 15:10:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cami Invia a cami un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!!
mi reinserisco in questa discussione perchè avrei bisogno di un consiglio per quanto riguarda l'estrazione dell'RNA da cellule con TRIzol... ho visto che ci sono diverse discussioni al riguardo, però non ho trovato la risposta precisa che cerco...
la questione è questa: devo estrarre RNA da campioni cellulari trattati e non trattati, piastrati su dish da 100, a diversi tempi. normalmente l'estrazione la faccio direttamente su piastra staccando le cellule con TRIzol, però siccome è un po' scomodo fare l'estrazione ogni giorno per tutti i campioni, vorrei conservarli a -80°C fino alla fine dell'esperimento e poi estrarre tutto insieme... allora la mia domanda è: qualcuno mi sa consigliare il metodo migliore per conservare i campioni?
le opzioni che mi vengono in mente sono:
- asciugo le piastre, le congelo, e poi il giorno dell'estrazione procedo come al solito come nulla fosse;
- stacco le cellule in tripsina, pelletto e poi il giorno dell'estrazione aggiungo il TRIzol seguendo il protocollo per cellule in sospensione;
- come sopra, però stacco le cellule con lo scraper;
- stacco le cellule con il TRIzol come faccio normalmente, metto in un'eppendorf e congelo tutto.
qualsiasi consiglio è prezioso, GRAZIE!!!
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