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bioalimentari
Nuovo Arrivato
Prov.: ce
Città: teano
36 Messaggi |
 Inserito il - 06 dicembre 2006 : 17:39:53
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AIUTO!...QUALCUNO DI VOI SAPREBBE SPIEGARI QUESTA CURVA USATA NELLA REAL-TIME PCR??????.......................GAZIE!!!!! 
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2006 : 20:15:14
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La curva di melting si usa quando fai real-time con SYBR green.
Il SYBR green è un intercalante aspecifico, quindi lega tutto il DNA ds, senza essere specifico per quello che stai amplificando, quindi se hai delle impurità, queste ti daranno un segnale addizionale oltre a quello del tuo campione, che non potrai distinguere.
Quello che si fa è misurare la fluorescenza all'aumentare della temperatura, ottenendo un grafico come questo (da http://www.uic.edu/depts/rrc/cgf/realtime/melt.html)
che puoi derivare per ottenere questo (solo per facilitare l'analisi)
Quando la temperatura è abbastanza alta da far denaturare il DNA perderai fluorescenza, perchè il SYBR Green non fluoresce in assenza di DNAds.
La Tm viene definita come il punto di flesso nella prima immagine, che corrisponde al massimo nella seconda, nell'esempio 82.5°.
Come vedi tutti i campioni hanno la stessa Tm, quindi puoi escludere quasi sicuramente amplificati aspecifici, che altrimenti ti darebbero altri picchi.
Altro controllo indispensabile è che il -RT e il no template siano piatti, in quanto non hanno amplificato.
PS: generalmente scrivere in maiuscolo su Internet equivale a gridare, non ce n'è bisogno!  |
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microbo
Nuovo Arrivato
117 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2006 : 21:22:55
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Io ne ho parlato durante la mia tesi di specialità sugli MRSA. la temperatura di Melting è la temperatura alla quale il 50% del DNA si trova in forma denaurata. A ogni prodotto di PCR corrisponde una temperatura di Melting caratteristica e la temperatura di Melting sarà quella temperatura in corrispondenza della quale si ha un repentino decremento della fluorescenza.
In breve, Io ho usato lo strumento Lightcycler per rilevare i ceppi MRSA basandosi sull'uso delle sonde FRET (Trasferimento di energia in risonanza) Nella figura in alto ci sono i ceppi OXacillina sensibili e quindi negativi e sotto i ceppi oxacillina resistenti con la temperatura di Melting di circa 65.66.2°C.
Immagine:
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bioalimentari
Nuovo Arrivato
Prov.: ce
Città: teano
36 Messaggi |
Inserito il - 06 dicembre 2006 : 22:03:31
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grazie, siete stati chiarissimi!....a quindi grazie alla curva di elting posso andare ad identificare anche i dimeri di primers??
p.s scusa per il maiuscolo, non sapevo che significave gridare.
ciao |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2006 : 00:28:44
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| In teoria credo di sì. Non ho mai usato il SYBR Green per la realtime, quindi non ho mai fatto praticamente una curva di melting, ma credo di sì! Magari microbo ce lo può confermare |
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bioalimentari
Nuovo Arrivato
Prov.: ce
Città: teano
36 Messaggi |
Inserito il - 07 dicembre 2006 : 09:29:43
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| grazie ancora... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2006 : 01:02:57
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Citazione:
Messaggio inserito da bioalimentari
quindi grazie alla curva di elting posso andare ad identificare anche i dimeri di primers??
Esatto! Se si formano dimeri di primers nella curva di melting vedrei 2 picchi:
- il picco specifico per il tuo amplificato
- un picco a Tmelting inferiore dovuto ai dimeri di primers
In generale se hai un picco solo corrisponde al prodotto specifico, se hai 2 picchi può essere dovuto alla presenza di prodotto aspecifico o di dimeri di primers.
Immagine:
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Immagine:
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p.s. nota che nei casi in cui hai la formazione dei due picchi (x es. curve rosse in figura) il picco specifico sarà più basso rispetto ai casi in cui hai solo un picco (curve verdi e viola). Invece nelle curve nere hai formazione solo del prodotto aspecifico!
Questo perche se hai formazione di prodotto aspecifico si forma meno prodotto specifico...
spero di essere stata chiara... visto l'ora!!!
Ciao  |
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bioalimentari
Nuovo Arrivato
Prov.: ce
Città: teano
36 Messaggi |
Inserito il - 08 dicembre 2006 : 11:02:40
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| sei stata chiarissima!...grazie veramente.ciao |
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afrodite81
Nuovo Arrivato
Città: Bari
10 Messaggi |
Inserito il - 30 marzo 2009 : 11:59:58
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wow...ho trovato questi grafici e queste risposte molto provvidenziali!Sto studiando la Real time ed il prof non si è soffermato molto sulla spiegazione!!! Vedremo più avanti... |
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Sacarolhas
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 05 maggio 2009 : 16:18:15
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a proposito di curve di melting...
leggo da alcuni appunti di lezione che è possibile individuare una mutazione in un allele utilizzando un oligonucleotide per la mutazione...
praticamente la mutazione dovrebbe essere rilevata perché la fluorescenza diminuisce rapidamente ad una certa temperatura di melting, che è più bassa rispetto al wt...
è così oppure non ho capito un H?
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283
Nuovo Arrivato
115 Messaggi |
Inserito il - 27 luglio 2012 : 16:30:34
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posso chiedere come si fa a predire la temperatura alla quale avrò il picco nella curva di melting? ovvero.. come posso capire che la temperatura alla quale osservo il picco nella real time con syber green è quella del mio prodotto?o cmq come posso calcolare la temperatura del mio prodotto ?
grazie infinite per le risposte |
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