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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
 Inserito il - 04 febbraio 2012 : 15:07:23
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Salve a tutti! Volevo fare una domanda sulla PCR... sulle slide della mia prof c'è scritto che per eliminare i falsi positivi bisogna abbassare la temperatura di reazione... non riesco a capire questa affermazione. Sapevo che ad esempio nell'ibridazione le temperature basse venivano usate in condizioni di bassa stringenza quindi per appaiare sequenze omologhe non al 100%, per cui non riesco a spiegarmi perchè invece nella PCR dobbiamo usare basse temperature per avere una reazione più specifica ed eliminare gli amplificati aspecifici. Spero di essermi spiegata correttamente e grazie a chi mi risponde.
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 04 febbraio 2012 : 15:36:46
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Secondo me quest'affermazione è vaga. Nello scegliere la temperatura di annealing, ci si basa su quella di melting dei due primers, sulla quale si basa la scelta dei primers stessi, nel senso che essi devono avere una Tm vicina. Quindi quando si imposta la Ta, lo si fa in riferimento alla Tm, e normalmente non si hanno aspecifici. Se si è in dubbio, o se la Tm dei primers è molto diversa, o ancora se non si è soddisfatti della specificità della reazione, si può fare una PCR in gradiente di temperatura, vale a dire che si valuta il prodotto di PCR su un certo range di Ta. Generalmente a Ta più basse della Ta ottimale, i primer si appaiano anche dove non dovrebbero, per cui si può incorrere in falsi positivi (extra bande dopo elettroforesi su gel e rivelazione), mentre a Ta troppo alte i primer fanno fatica ad appaiarsi, e avrai una banda più flebile. Questo è ciò che io osservo dopo elettroforesi di prodotti di PCR amplificati ad un determinato gradiente di temperatura, per cui concordo con te.
Ma forse possiamo aspettare che qualcun altro risponda, per confermare ciò che sappiamo. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 05 febbraio 2012 : 00:33:15
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Sì concordo con quanto detto da roberta.s
Citazione:
Generalmente a Ta più basse della Ta ottimale, i primer si appaiano anche dove non dovrebbero, per cui si può incorrere in falsi positivi (extra bande dopo elettroforesi su gel e rivelazione), mentre a Ta troppo alte i primer fanno fatica ad appaiarsi, e avrai una banda più flebile.
- per aumentare la "specificità" si aumenta la temperatura
- per aumentare la "sensibilità" si diminuisce la temperatura
Se sulle slide c'è realmente scritto "che per eliminare i falsi positivi bisogna abbassare la temperatura" è sicuramente un errore. |
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moni89
Nuovo Arrivato
60 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2012 : 13:04:40
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| Vi ringrazio :) quindi in realtà per eliminare i falsi positivi devo fare praticamente il contrario, cioè aumentare la temperatura.. giusto?? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 06 febbraio 2012 : 18:15:16
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Citazione:
Messaggio inserito da moni89
Vi ringrazio :) quindi in realtà per eliminare i falsi positivi devo fare praticamente il contrario, cioè aumentare la temperatura.. giusto??
Sì esatto! |
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