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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 15 febbraio 2012 : 15:51:09
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Vorrei fare dei test preliminari per vedere se una certa sostanza può indurre cambiamenti epigenetici.
Prima di gettarmi in tecniche "complicate" di biologia molecolare (tipo ChIP) vorrei fare qualche test veramente di base per vedere se la mia teoria ha senso.
Avevo pensato ad es. a fare un Western blot (o IHC o realtime) per DNMT (o qualche enzima di questo tipo) su tessuto proveniente da animali controllo o trattati con la sostanza.
Vorrei sapere:
1) secondo voi può essere utile fare questo primo step (sono cosciente del fatto che vedrei solo una modulazione della quantità di enzima e non della sua attività ma, ribadisco, sono solo dei test preliminari)
2) quale/i enzima/i mi consigliate di andare a guardare?
3) potete suggerirmi degli anticorpi specifici?
4) volendo andare più in là, che tecniche mi consigliereste di usare per analizzare specifici geni target? Ho visto che esistono dei kit già pronti: vale la pena di usarli (contate che di base sono elettrofisiologo e che in lab facciamo poca biologia molecolare)?
Ogni consiglio a riguardo è ben accetto
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2012 : 16:24:35
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| Non so, mi viene in mente che potresti fare dei western usando Ab contro le forme acetilate degli istoni (tipo acetyl-histone 3, acetyl-histone 4 (Upstate Biotechnology) ) per vedere se il tuo composto ha un'azione su tali modifiche epigenetiche; oppure tentare con un saggio enzimatico per HDAC, HAT, DNMT, o l'enzima a cui più sei interessato. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 febbraio 2012 : 18:12:50
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
4) volendo andare più in là, che tecniche mi consigliereste di usare per analizzare specifici geni target? Ho visto che esistono dei kit già pronti: vale la pena di usarli (contate che di base sono elettrofisiologo e che in lab facciamo poca biologia molecolare)?
Come screening di "base" un po' per andare a vedere dove sbattere la testa insomma, potresti provare con i PCR-Array. Costicchiano ma... in Francia non avete grossi problemi di fondi!  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2012 : 13:18:04
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Hmmm quella dei PCR Array non è una malvagia idea, anche per altre cose in realtà.
roberta, per i saggi enzimatici me ne sai consigliare qualcuno in particolare? |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2012 : 13:27:25
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Chick, ti riporto una parte dei "Materiali e metodi" di un paper proveniente dal mio precedente lab, che lavora sull'epigenetica:
Fluorimetric HDAC1 and 4 assays
The HDAC Fluorescent Activity Assay is based on the Fluor de Lys Substrate and Developer combination (BioMol) and has been carried out according to supplier’s instructions. First, the Fluor de Lys Substrate, which comprises an acetylated lysine side chain, has been incubated with purified recombinant HDAC1, 4 enzymes in presence or absence of the inhibitors. Deacetylation of the substrate sensitizes the substrate so that, in the second step, treatment with the Developer produces a fluorophore. Fluorescence has been quantified with a TECAN inphinite M200 station.
Questo è solo un esempio, non so se fa al caso tuo. Essenzialmente si misura l'attività di una HDAC, quindi una istone deacetilasi, in presenza o meno di un composto con presunta azione epigenetica.
Ecco il link della casa produttrice, magari trovi saggi per l'enzima che più ti interessa
http://www.enzolifesciences.com/landing-page/fcode/131/
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 17 febbraio 2012 : 14:51:56
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| Perfetto! |
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Detezione di cambiamenti epigenetici
