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sparkina
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6 Messaggi |
 Inserito il - 22 febbraio 2012 : 22:39:19
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Buonasera a tutti,
vorrei sapere se qualcuno di voi ha esperienza di immunoistochimica condotta su fette (2 um) di campione fissato in formalina e incluso in paraffina posto su vetrini da microdissezione laser, per poi fare la raccolta delle cellule risultate positive.
Sto cercando di mettere a punto questo tipo di analisi nel mio laboratorio ma i vetrini da microdissezione hanno una membrana molto delicata che tende a staccarsi con i normali step dell'immunoistochimica, specialmente quello dello smascheramento.
Inoltre al termine dell'analisi non posso disidratare e montare il vetrino con il coprioggetto ma devo lasciarlo seccare all'aria.
Cerco quindi consigli e suggerimenti, anche ovviamente da chi non l'ha mai fatto ma può aiutarmi.
Grazie!
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 29 febbraio 2012 : 21:51:44
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ciao, mi sto approcciando anche io a questa tecnologia, devo dire che per la mia finora breve esperienza non è per niente semplice ottenere mRNA sufficiente e di buona qualità da sezioni in paraffina dopo immuno-LCM. A maggior ragione possiamo sfruttare questa discussione per scambiarci le opinioni e tutti i possibili accorgimenti per ottimizzare il protocollo! Premetto che ora sto lavorando principalmente su altre cose, ma a breve mi servirà utillizzare questa tecnica.
Sezioni di 2 uM sono davvero sottili, prova a utilizzare sezioni di spessore tra i 5 e i 10 uM.
Altra cosa, hai provato con i classici vetrini? |
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sparkina
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 11 marzo 2012 : 18:36:11
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Si, ho provato la doppia immuno con i vetrini caricati elettrostaticamente per mantenere fissate le sezioni (hanno i segni segni + agli angoli estremi). Alla fine dell'immuno ho messo un montante acquoso (glicerolo) e il coprioggetto. In effetti l'analisi viene e riesco a vedere le doppie positive.
Ho provato a farla anche su vetrini con la membrana per la microdissezione ma in quasi tutti la sezione si è staccata durante i vari passaggi, inoltre non potendo coprire e non potendo disidratare con passaggi in etanolo e xilolo (perchè uno dei due comogeni è solubile in alcol, solo la DAB non lo è perciò ogni kit per la doppia immuno avrà uno dei due cromogeni solubile) ho disidratato all'aria ma l'immagine al microscopio è davvero pessima ed è impossibile individuare le cellule doppie positive.
In letteratura ho trovato un lavoro di immuno-lcm che su FFPE. Loro hanno messo a punto un protocollo con particolari accorgimenti nel trattamento dei vetrini prima dell'analisi (trattamento con UV e con poli-L-lisina) e durante lo smascheramento antigenico.
Il problema della doppia immuno e del cromogeno solubile però rimane infatti ne condurrò due singole (con due kit che utilizzando entrambi la DAB) piuttosto che una doppia. Adesso sto aspettando i vari reagenti che ho ordinato e appena ho tutto comincerò.
Le sezioni da 2um sono quelle raccomandate per l'immuno, almeno così mi hanno insegnato, la paraffina meno ce n'è meglio è. Però potrei provare magari da 4-5um. 10um sono troppi sicuramente.
Lo so per l'mRNA sarà veramente difficile. Abbiamo un kit apposta per microdissezioni da FFPE, inoltre dopo vorrei usare un WTA per amplificare l'intero trascrittoma. |
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