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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
 Inserito il - 29 luglio 2004 : 10:04:08
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ciao a tutti!
è la prima volta che scrivo nel forum e ne approfitto anche per presentarmi!
non c'è molto da dire in verità: sono di reggio emilia, laureata da poco in agraria e da poco assunta dall'università di bologna con uno di quei fantastici contrattini a tempo determinato!!!  cmq, non mi lamento, per l'amor del cielo...
ho bisogno di un vostro parere riguardo al sequenziamento di DNA plasmidico appunto...qualcuno di voi ha esperienza della cosa?
in particolare vorrei sapere come trattare il DNA prima della spedizione al cribi (noi abbiamo un sequenziatore qui ma lo usano per altro...fate vobis...).
se devo purificarlo oppure no, le loro spiegazioni sul sito sono piuttosto vaghe...
se qualcuno di voi potesse aiutarmi ne sarei molto felice!
salute e felicità!
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Rando
Nuovo Arrivato
Prov.: Lodi
17 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2004 : 10:37:59
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Ciao e benvenuta.
Io trovo che le informazioni del cribi a questa pagina
non siano così vaghe, ma forse perché non sono un esperto di sequenziamento.
Mi è parso di capire cmq che il DNA debba essere fornito purificato...
cito: "ottimi risultati di sequenziamento, a condizione che il DNA sia specifico (banda singola) e ben purificato"
"IN GENERALE IL DNA DEVE ESSERE:
- PULITO
Privo di sali, proteine, fenolo, resine, altri acidi nucleici (nucleotidi, primer ed RNA).
- UNICO DNA derivante da un solo clone batterico o fagico.
Una sola banda se si tratta di prodotto di PCR.
- CORRETTAMENTE QUANTIZZATO (vedi sotto) "
Cosa ti serve sapere in particolare?
ciao
Rando
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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
Inserito il - 29 luglio 2004 : 10:54:42
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sul sito si riferiscono quasi sempre a prodotto amplificato mentre laddove si parla di plasmidi e vettori non è ben specificato se la purificazione è necessaria o no.
a questo punto mi sorge il dubbio se non sia meglio effettivamente amplificare con i primer standard del kit di clonaggio e mandare quel prodotto dopo la purificazione.
il dubbio mi sorge perchè i miei colleghi mi hanno detto di dare un'occhiata alle procedure di preparazione dei campioni anche se loro sono piuttosto sicuri che basti essiccare la giusta quantità di DNA plasmidico estratto con miniprep e mandare direttamente quella...
cosa che, effettivamente, non risulta neanche a me!
per togliermi ogni dubbio sentirò direttamente quelli del cribi...
ti ringrazio della risposta, sei stato velocissimo!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 30 luglio 2004 : 09:24:52
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Penso che tu glielo debba dare purificato... credo che loro sequenzino tutto ciò che gli arriva nella eppendorf, senza fare eccessivi trattamenti prima, quindi se non vuoi avere tutta la sequenza del plasmide (che hai già suppongo...) dovresti dargli solo l'inserto.
nICO |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 30 luglio 2004 : 18:47:43
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io ho svolto il tirocinio in un laboratorio dell'università di Padova.. e mandavamo spesso sequenze al CRIBI. Noi mandavamo giuste quantità di DNA plasmidico essiccato, ottenuto mediante miniprep! In più mandavamo il plasmide intero, con un primer (o due, a seconda della lunghezza dell'inserto) in modo che loro potessero amplificare la regione del plasmide prossima all'inserto. Così puoi anche assicurarti che l'inserto sia in frame.. |
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michela
Nuovo Arrivato
Prov.: Reggio Emilia
23 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2004 : 14:39:52
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valia!
sei manna dal cielo!
sai anche dirmi come (e se) quantificavate il DNA?
ho dei dubbi sull'uso dello spettrofotometro (che mi hanno fatto usare).
non sarebbe più appropriata una quantificazione su gel?
confido in te!
grazie e buon fine settimana!
michela |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 31 luglio 2004 : 15:53:47
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Noi quantificavamo mediante gel!! In realtà non penso sia molto preciso, ma penso anche che per quelli del CRIBI non sia un grosso problema! Poi mettavamo +/- 500 ng di DNA nell'eppendorf ed infine facevamo evaporare l'H2O con un normale termociclatore!
Nel caso in cui il tuo inserto sia lungo, ti servono due primer (forward e reverse), e quindi devi fare due diverse provette, ognuna con 500 ng di DNA dello steso campione.
Io non sono molto esperta, ma non credo che ci siano problemi se tu usi lo spettrofotometro!! Bho! se hai altri dubbi chiedi pure.. finora ho usato questo forum solo per fare domande.. adesso mi sento anche utile!!! |
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Sequenziamento DNA plasmidico
Didattica
