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ruffetta
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Inserito il - 28 febbraio 2012 : 16:03:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ruffetta Invia a ruffetta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
Helpdopo una giornata intera dietro una immuno doppia c-kit ed hERG non ├Ę venuto nulla...
Ho usato l'EDTA per smascherare, sapete se possa essere stato un errore???? cosa consigliate per smascherare??? avete già fatto una immuno simile? avete un protocollo da girarmi???

GRAZIE!!!!

biotool
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97 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:13:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biotool Invia a biotool un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Parti da sezioni ffpe? se scrivi maggiori dettagli magari Ŕ pi¨ utile per capire meglio ed esserti pi¨ utili, di solito lo smascheramento Ŕ standard (sodio citrato di solito funziona bene)a meno che non sia richiesto un trattamento particolare per l'ab che usi (controlla il datasheet)
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Archimedes
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CittÓ: Boston, MA


20 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:15:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Archimedes  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Archimedes Invia a Archimedes un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm... sei sicura che sia dato dallo smascheramento? ma non e' venuto proprio nulla o hai un segnale debole? comunque prova con il Citric Buffer pH 6.. microwave 10 minuti... cotto e mangiato.. :)
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ruffetta
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:19:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ruffetta Invia a ruffetta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Giusto!
parto da sezioni in paraffina. Il problema ├Ę stato che per il c-kit (Dako) non si pu├▓ usare la proteinasi K perch├Ę viene indicata sul datasheet che ditrugge l'epitopo e il citrato sul datasheet viene indicato essere poco marcante. Adesso proveremo comunque ad usare il citrato. Tu che ne pensi?
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ruffetta
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6 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:22:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ruffetta Invia a ruffetta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Archimedes, nel dire che non ├Ę venuto nulla mi sono espressa male: ├Ę venuto un tappeto marrone dato dalla DAB che avrebbe dovuto marcare hERG. Prima le ICC (c-Kit) sono venute bene marcate dal Fast Red.
Voi usate mettere insieme gli anticorpi per fare la immuno in doppio o fate separato con incubazioni separate?
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biotool
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97 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 18:23:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biotool Invia a biotool un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai bloccato con siero?
Cosa consigliano di usare come smascheramento per tuoi anticorpi?
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Archimedes
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CittÓ: Boston, MA


20 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 20:27:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Archimedes  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Archimedes Invia a Archimedes un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
eheh Penso che c-kit e' un bel casino ogni tanto :)
Comunque, solitamente facciamo incubazioni separate. Anche se qualcuno le fa insieme e si risparmia un po' di tempo ;) un altro consiglio, ora che ci penso, in teoria potresti anche usare il water bath a 95 gradi se vedi che il microonde danneggia troppo le tue slides. Citric Buffer.. sodio citrato e acido citrico 10mM e il pH dev'essere perfetto.
Il bloccaggio e' sempre meglio farlo..

Fammi sapere

Buon lavoro
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biotool
Nuovo Arrivato



97 Messaggi

Inserito il - 28 febbraio 2012 : 20:53:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biotool Invia a biotool un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
quoto Archimedes in generale, per quanto riguarda c-kit in particolare non ho esperienza, forse questo link pu˛ esserti utile: http://www.ihcworld.com/_protocols/antibody_protocols/cd117_dako.htm
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ruffetta
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 29 febbraio 2012 : 15:54:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ruffetta Invia a ruffetta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao! iniziata oggi la prova se col c-kit possa andare bene il citrato
Domanda??? Ho per sbaglio messo l'Ultra V block (Labvision) subito dopo la bollitura e raffreddamento con citrato. Dopo 3 min mi sono accorta dell'errore...PANICO!! ho fatto poi i 3 lavaggi in PBS che avrei dovuto fare prima: pensate possa aver danneggiato qualcosa??? poi ho rimesso l'Ultra V block e l'anticorpo primario.

ciao ciao e buon lavoro!!!
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biotool
Nuovo Arrivato



97 Messaggi

Inserito il - 29 febbraio 2012 : 17:49:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di biotool Invia a biotool un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Direi di no, tranquilla!

Facci sapere come Ŕ andata...
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ruffetta
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6 Messaggi

Inserito il - 27 ottobre 2012 : 22:45:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ruffetta Invia a ruffetta un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao biotool e archimedes,
vi scrivo scusamdomi per non aver risposto sull'esito dell'immuno dopo i vostri consigli...
adesso ho anche un po' pi├╣ di esperienza e vi dico che per il c-kit il citrato va benissimo. anche in doppia si pu├▓ usare senza problemi. il risultato di quella immuno ├Ę stato positivo, ├Ę venuta e abbiamo visto i neuroni nel plesso mienterico di ileo malato di Crohn's Disease. Li abbiamo visualizzati per├▓ meglio col PGP 9.5.

Grazie e spero che il vostro lavoro proceda bene!
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