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ruffetta
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 Inserito il - 28 febbraio 2012 : 16:03:44
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ciao a tutti!
Help dopo una giornata intera dietro una immuno doppia c-kit ed hERG non è venuto nulla...
Ho usato l'EDTA per smascherare, sapete se possa essere stato un errore???? cosa consigliate per smascherare??? avete già fatto una immuno simile? avete un protocollo da girarmi???
GRAZIE!!!!
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:13:04
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| Parti da sezioni ffpe? se scrivi maggiori dettagli magari è più utile per capire meglio ed esserti più utili, di solito lo smascheramento è standard (sodio citrato di solito funziona bene)a meno che non sia richiesto un trattamento particolare per l'ab che usi (controlla il datasheet) |
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Archimedes
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Città: Boston, MA
20 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:15:59
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| mmm... sei sicura che sia dato dallo smascheramento? ma non e' venuto proprio nulla o hai un segnale debole? comunque prova con il Citric Buffer pH 6.. microwave 10 minuti... cotto e mangiato.. :) |
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ruffetta
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6 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:19:18
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Giusto!
parto da sezioni in paraffina. Il problema è stato che per il c-kit (Dako) non si può usare la proteinasi K perchè viene indicata sul datasheet che ditrugge l'epitopo e il citrato sul datasheet viene indicato essere poco marcante. Adesso proveremo comunque ad usare il citrato. Tu che ne pensi?
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ruffetta
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6 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2012 : 17:22:53
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Archimedes, nel dire che non è venuto nulla mi sono espressa male: è venuto un tappeto marrone dato dalla DAB che avrebbe dovuto marcare hERG. Prima le ICC (c-Kit) sono venute bene marcate dal Fast Red.
Voi usate mettere insieme gli anticorpi per fare la immuno in doppio o fate separato con incubazioni separate? |
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2012 : 18:23:28
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Hai bloccato con siero?
Cosa consigliano di usare come smascheramento per tuoi anticorpi? |
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Archimedes
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Città: Boston, MA
20 Messaggi |
Inserito il - 28 febbraio 2012 : 20:27:21
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eheh Penso che c-kit e' un bel casino ogni tanto :)
Comunque, solitamente facciamo incubazioni separate. Anche se qualcuno le fa insieme e si risparmia un po' di tempo ;) un altro consiglio, ora che ci penso, in teoria potresti anche usare il water bath a 95 gradi se vedi che il microonde danneggia troppo le tue slides. Citric Buffer.. sodio citrato e acido citrico 10mM e il pH dev'essere perfetto.
Il bloccaggio e' sempre meglio farlo..
Fammi sapere
Buon lavoro
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biotool
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97 Messaggi |
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ruffetta
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 29 febbraio 2012 : 15:54:39
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ciao! iniziata oggi la prova se col c-kit possa andare bene il citrato
Domanda??? Ho per sbaglio messo l'Ultra V block (Labvision) subito dopo la bollitura e raffreddamento con citrato. Dopo 3 min mi sono accorta dell'errore...PANICO!! ho fatto poi i 3 lavaggi in PBS che avrei dovuto fare prima: pensate possa aver danneggiato qualcosa??? poi ho rimesso l'Ultra V block e l'anticorpo primario.
ciao ciao  e buon lavoro!!! |
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biotool
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97 Messaggi |
Inserito il - 29 febbraio 2012 : 17:49:26
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Direi di no, tranquilla!
Facci sapere come è andata... |
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ruffetta
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6 Messaggi |
Inserito il - 27 ottobre 2012 : 22:45:06
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ciao biotool e archimedes,
vi scrivo scusamdomi per non aver risposto sull'esito dell'immuno dopo i vostri consigli...
adesso ho anche un po' più di esperienza e vi dico che per il c-kit il citrato va benissimo. anche in doppia si può usare senza problemi. il risultato di quella immuno è stato positivo, è venuta e abbiamo visto i neuroni nel plesso mienterico di ileo malato di Crohn's Disease. Li abbiamo visualizzati però meglio col PGP 9.5.
Grazie e spero che il vostro lavoro proceda bene! |
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