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Kika412
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 29 febbraio 2012 : 10:36:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Kika412 Invia a Kika412 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve ragazzi, devo utilizzare per la prima volta il FACS ed avrei una domanda da porvi, devo valutare l'espressione genica di alcune proteine (marcate con anticorpi) in cellule endoteliali immortalizzate, secondo voi quante cellule per campione sarebbe meglio avere per ottenere una lettura ottimale?

Grazie

Kika412
Nuovo Arrivato



3 Messaggi

Inserito il - 29 febbraio 2012 : 13:40:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Kika412 Invia a Kika412 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Visto che mi trovo ne faccio un'altra, per quanto riguarda gli anticorpi...

Ho un anticorpo anti-CD9 FITC ad una concentrazione 0,5 mg/ml, sul data sheet c'è scritto che per immunofluorescenza è meglio utilizzare 1microg ogni milione di cellule in 100 microlitri.
quindi devo mettere 2microlitri di anticorpo in 100 microlitri per milione??
Mi sembra un po' poco.

Qualcuno potrebbe delucidare
Pleaseeeeeeeeeeeee
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Holland
Nuovo Arrivato



23 Messaggi

Inserito il - 05 marzo 2012 : 15:49:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Holland Invia a Holland un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si il calcolo e' giusto, anche se sembra poco. Gli anticorpi sono generalmente molto concentrati, talvolta se ne possono usare anche 0.5 ul, a seconda di cosa trovi scritto nel TDS..

Per il numero di cellule posso pero' dirti che con le mie colture di monociti e/o linfociti acquisisco 50,000 eventi e di solito nel campione metto dalle 150,000-200,000 cellule (a volte anche molto meno).. Magari fai delle prove, io partirei da almeno 250,000 cellule, poi la prossima volta ti puoi regolare meglio..
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Dionysos
Moderatore

D

Città: Heidelberg


1913 Messaggi

Inserito il - 05 marzo 2012 : 16:00:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Dionysos  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Dionysos Invia a Dionysos un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se sono cellule endoteliali immortalizzate non dovresti avere problemi
di numero. Comunque il minimo sarebbe 50 000 cellule in 50 ul (conc. finale
di 1 milione/ml). Mantenendo tale concentrazione puoi salire fino a una o più
centinaia di migliaia, ma poi ricorda che dovrai salire anche con il volume
complessivo e quindi dovrai usare molto più anticorpo. Fai i tuoi conti.

Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)

Less Jim Morrison, more Sean Morrison!


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Chiarissima
Nuovo Arrivato

Disegno B&W



6 Messaggi

Inserito il - 11 ottobre 2012 : 17:59:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Chiarissima Invia a Chiarissima un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti! Avrei bisogno di qualche informazione da parte di chi abitualmente usa il FACS per sortare cellule sulle quali lavora in seguito. E' possibile recuperare delle cellule dal FACS e su esse realizzare un WB affidabile, o la permeabilizzazione con EtOH interferisce in quache modo (Es. perdita di materiale proteico post-permeabilizzazione)?
Volendo, si può evitare l'utilizzo di EtOH? Premetto che la necessità è recuperare la sottopopolazione cellulare in G1.

Grazie mille
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