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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
 Inserito il - 06 marzo 2012 : 15:17:45
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Ciao ho un problema con le quantità che devo usare per un clonaggio con il cloneEZ PCR cloning kit.
Qst è la procedura (riporto esattamente quanto scritto sul datasheet):
1)Linearized vector (100-200 ng/uL) 6uL
2)Purified PCR products (100-200 ng/uL) nuL
3)10X CloneEZ buffer 2uL
4)CloneEZ Enzyme 2uL
5)H2O up to 20uL
Io ho fatto cosi' ma non so se è giusto visto che i cloni che mi vengono sono tutti uguale al controllo, ovvero non ho inserito il mio frammento. Quindi forse c'è troppo vettore.
1) Avendo una quantitä di 131 ng/uL metto 6uL come mi dice il protocollo. Quindi in teoria metto una quantità di 786 ng (131*6)
2)Ho una quantità di 36ng/uL. Qui nasce il problema.
Il mio inserto dev'essere per forza rientrante nella concentrazione 100-200ng/uL? Io non ho tale quantità per uL.
Il datasheet non è molto chiaro. Io ho fatto cosi': ho messo la quantità per prendere 200ng. Quindi 5,5 uL. Quindi in 5,5uL ho 200ng. Ma stando al protocollo devo avere 100-200ng/uL. Io avrei invece in tal modo 200ng/5.5= 36ng circa
Quindi come devo interpretare il 2) se io ho una concentrzione di 36ng/uL. Potrei riottenere il frammento per avere concentrazioni maggiori ma mi sembra difficile...alla fine purificando la banda dal gel ottengo circa sempre la quantità che ho.
Vi ringrazio e spero non si troppo complicato.
Ciao
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2012 : 15:20:38
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| Hai provato a cercare nel forum? Ci sono decine di discussioni sul clonaggio, con consigli annessi. Se poi hai ancora dubbi, chiedi pure. |
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2012 : 21:31:24
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Ciao
Avevo già cercato per il CloneEZ ma non c'è niente. Per tutto il resto di come si clona c'é un sacco! ...ma a me serve qlc specificamente per qst tecnica.
Grazie |
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roberta.s
Utente Junior
Città: Parigi
564 Messaggi |
Inserito il - 06 marzo 2012 : 21:45:12
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Sì, ma il principio è lo stesso! Se segui il protocollo, devi:
- aggiungere alla reazione circa 600 ng totali di vettore linearizzato, e fin qui ci siamo;
- calcolare la quantità di inserto da utilizzare (che il protocollo ipotizza sia, dopo PCR e successiva purificazione, alla concentrazione di circa 200 ng/uL). Tu hai male inteso le indicazioni del protocollo, che non dice affatto di utilizzare 200 ng di inserto, ma di usarne x uL in base alla concentrazione iniziale ed al rapporto che intendi adottare tra vettore ed inserto.
Mi spiego. Generalmente, si fa avvenire la reazione di ligation tra vettore ed inserto ponendo l'inserto in eccesso rispetto al vettore. Ad esempio puoi impostare la reazione in modo che il rapporto vettore:inserto sia pari a 1:3. Per fare ciò, applichi la seguente formula:
[ng vettore (nel tuo caso 786 ng) x kb inserto] / kb vettore x 3 = ng inserto da utilizzare
Questo vale per ogni clonaggio, con qualunque kit utilizzi. |
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liciageno
Nuovo Arrivato
107 Messaggi |
Inserito il - 07 marzo 2012 : 11:56:51
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Grazie in effetti è proprio cosi' che devo interpretarlo. Mi hai chiarito le idee.
Ciao :) |
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Quantità inserto per clonaggio
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