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federico
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 04 agosto 2004 : 11:08:46
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Ciao a tutti, ho un grosso problema.
Non riesco a ottenere la ligazione tra un plasmide EGFP e un inserto di 500bp. Ho fatto tute le verifiche: siti restrizione, T4, concentrazioni. L'unica cosa che sono riuscito ad ottenere è stata una colonia che ha il mio inserto ma che crwce a una concentrazione di Kanamicina di 5ug/ml rispetto ai 30ug/ml con cui cresceva il plasmide EGFP da solo, e non riesco ad ottenerne in quantità tale da fare poi le analisi. EGFP ha lo stessa origine di replicazione del pUC, quindi è ad alto numero di copie.
Come posso fare?
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terreno85
Utente Junior
235 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2009 : 19:51:37
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| mmm bhe inizia a fare un sequenziamento del plsmide possibile che abbia qualche mutazione nei siti di restizioni che hai utilizzato.. |
Una teoria può esserre provata da un esperimento. Ma nessun percorso guida dall'esperimento alla nascita di una teoria |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 01 settembre 2009 : 19:56:40
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Altrimenti ci sono i vettori di clonaggio easy
(pGEM, pCR-TOPO, ecc.) che ti potrebbero aiutare
se amplifichi il frammento tramite Taq. Una volta
infilato il tuo inserto dentro di quelli, puoi
ri-tagliarli, in modo più affidabile, e trasferire
il nuovo inserto nel tuo plasmide di destinazione.
Citazione:
una colonia che ha il mio inserto ma che crwce a una concentrazione di Kanamicina di 5ug/ml rispetto ai 30ug/ml con cui cresceva il plasmide EGFP da solo, e non riesco ad ottenerne in quantità tale da fare poi le analisi
Questa proprio non l'ho capita! per quale strano
motivo al mondo una colonia non ti basterebbe? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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